Pracownia Biologii Molekularnej II/Plan ćwiczeń

Pracownia Biologii Molekularnej

Część II

Plan ćwiczeń wykonywanych w ramach Pracowni Biologii Molekularnej, część II — Ekspresja i oczyszczanie białek.

I spotkanie: Ekspresja białka w komórkach E. coli

Materiały i aparatura niezbędne do wykonania ćwiczenia I

• Pożywka LB z agarem do hodowli stałej.
• Roztwór ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
• Szalki Petriego.
• Cieplarka.
• Palnik, zapałki, 70% roztwór etanolu, eza.
• Pipety, sterylne tipsy o pojemności do 200 [math]\mu[/math]l.

Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotować i podpisać szalki Petriego.
2. Roztopić w mikrofalówce pożywkę LB z agarem o objętości 50 ml dla każdej pary osób wykonujących ćwiczenie, a następnie schłodzić do temperatury ok. 40 – 50°C, czyli takiej, przy której nie odczuwamy parzenia przy dotykaniu naczynia ręką.
3. Gdy pożywki są ochłodzone dodać 50 μl ampicyliny o stężeniu wyjściowym 100 mg/ml uzyskując stężenie końcowe 100 μg/ml.
4. Rozlać pożywkę stałą na szalki Petriego.
5. Włączyć i ustawić cieplarkę na 37°C.
6. Szalki wstawić do cieplarki w celu wysuszenia na około pół godziny.
7. Po wysuszeniu wykonać posiew redukcyjny przenosząc, za pomocą ezy wysterylizowanej w płomieniu palnika, bakterie zawierające wektor z plazmidem białka na szalkę Petriego.
8. Szalkę wstawić do cieplarki i przechować w niej do następnego dnia.
9. Następnego dnia osoba wskazana przez asystenta przenosi szalki z cieplarki do lodówki.

II spotkanie: Ekspresja białka w komórkach E. coli — ciąg dalszy

Materiały i aparatura niezbędne do wykonania ćwiczenia II

• Kolby z 50 ml pożywki LB do hodowli płynnej.
• Roztwór ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
• Roztwór IPTG o stężeniu 1M.
• Cieplarko-wytrząsarka.
• Palnik, zapałki.
• Pipety i sterylne tipsy .

Wykonanie ćwiczenia

1. Podpisać kolbę o objętości 250 ml. Jedna z osób przygotowuje dwie kolby i czynności 1-6 wykonuje dla obydwu kolb.
2. Przygotować w opisanej kolbie, w obecności włączonego palnika gazowego 50 ml LB
3. Dodać do kolby 50 μl ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml.
4. Do kolby dodać za pomocą pipety z wysterylizowaną końcówką 1 ml hodowli nocnej.
5. Wstawić do wytrząsarki i energicznie wytrząsać w temperaturze37°C.
6. Pobierać co 30 minut 1,5 ml roztworu i sprawdzać OD. Dane umieścić w tabeli. Roztwór po pomiarze wylewać do przygotowanego pojemnika do sterylizacji.
7. Po osiągnięciu OD600 w zakresie 0.5 – 0.7 zaindukować hodowlę dodając do kolby 50 μl IPTG o stężeniu wyjściowym 1M uzyskując stężenie końcowe 1 mM. Osoba, która przygotowała dwie kolby do jednej z nich NIE dodaje IPTG.
8. Wstawić kolby do wytrząsarki.
9. Po odpowiednim czasie (1, 2, 3, 4 godziny) pobierać po 1 ml z każdej kolby do sterylnej opisanej ependorfówki. Zapisać oznaczenia ependorfówek.
10. Odwirować osad.
11. Supernatant wylać do zbiornika, w którym zostanie wysterylizowany.
12. Osad zawiesić w 50 μl buforu denaturującego i zamrozić w temperaturze -80°C.
13. Po zakończeniu hodowli pobrać po 5 ml z kolby do sterylnej opisanej falkonówki i odwirować osad.
14. Supernatant wylać do zbiornika, w którym zostanie wysterylizowany.
15. Osad zamrozić w falkonówce w temperaturze -80°C.

III spotkanie: Kontrola wydajności ekspresji białka w E. coli metodą elektroforezy denaturującej

Odczynniki niezbędne do wykonania ćwiczenia III

• Odczynniki do przygotowania żeli:
  • 30% roztwór akrylamidów,
  • woda dejonizowana,
  • TEMED,
  • 10% APS,
  • 1.5 M bufor Tris-HCl, pH 8.8,
  • 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8,
  • 10% SDS;
• barwnik denaturujący do białek (5x stężony),
• bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE 1x stężony,
• barwnik do barwienia żelu po elektroforezie (BioRad),
• etanol do mycia szybek elektroforetycznych,
• elektroforetyczny marker białkowy.

Przygotowanie i przeprowadzenie elektroforezy

Przygotowanie żelu poliakrylamidowego.

1. Starannie umyć szybki elektroforetyczne wodą, wytrzeć ręcznikiem papierowym i przetrzeć wewnętrzne powierzchnie etanolem.
2. Każda z osób składa ze sobą dwie szybki (szybkę krótszą i dłuższą) w taki sposób, aby dolne krawędzie szyb były na jednym poziomie, a spacer’y znajdowały się w wewnętrznej przestrzeni pomiędzy płytkami.
3. Złożone szybki spiąć za pomocą przeznaczonych do tego klamr i zamocować na podstawce do wylewania żeli.
4. Sporządzić roztwór żelu separującego (dolnego) o odpowiednim stężeniu (według Tab. Figure 1).
   Ponieważ objętości roztworów (10 ml dla żelu separującego i 3 ml dla żelu ściągającego) wystarczają na przygotowanie dwóch żeli studenci przygotowują roztwory parami.

   Typ żelu	Woda dejonizo-wana	30% akrylo-amid	1.5 M Tris-HCl pH 8.8	0.5 M Tris-HCl pH 6.8	10% SDS	10% APS	TEMED	Całkowi-ta objętość
   Żel ściąga-jący 4%	1.82 ml	0.42 ml	-------	0.75 ml	30 μl	30 μl	3 μl	3 ml
   Żel separu-jący 12 %	3.4 ml	4.0 ml	2.5 ml	--------	100 μl	70 μl	7 μl	10 ml

   Figure 1: Skład 12 % żelu separującego (dolnego) i 4% żelu ściągającego (górnego) . Objętość przygotowanego roztworu wynosi odpowiednio 10 i 3 ml i wystarcza na wylanie dwóch płytek.
   1. Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki oprócz TEMEDU i APS.
   2. Odgazowywać roztwór przez 10 minut (opcjonalnie).
   3. Dodać APS i TEMED.
5. Szybko wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego i grzebień.
6. Po wylaniu żelu upewnić się, że nie ma w nim bąbli powietrza.
7. W celu odcięcia dostępu tlenu przeszkadzającego polimeryzacji na żel nalać ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (45 minut).
8. Po spolimeryzowaniu żelu separującego przygotować żel ściągający według Tab.1.
   1. Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki oprócz TEMEDU i APS.
   2. Odgazowywać roztwór przez 10 minut (opcjonalnie).
   3. Dodać APS i TEMED
9. Szybko zlać wodę znad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym.
10. Natychmiast wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do ich górnej granicy. Uważać aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
11. Ostroznie włożyć grzebień.
12. Pozostawić do polimeryzacji (30 - 45 minut)

Przygotowanie układu do elektroforezy

1. Zdjąć złożone szybki z żelem z podstawki i wstawić do aparatu do elektroforezy
2. Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym). Napełnić buforem naczynie elektrodowe tak, aby górna i dolna część żelu były zanurzone w buforze.
3. Wyjąć ostrożnie grzebień z żelu. Uważać aby nie oderwać fragmentów żelu.
4. Za pomocą pipety automatycznej usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej części żelu.

Przygotowanie i nanoszenie próbek

1. Przygotować łaźnię wodną lub włączyć blok grzejny i nastawić temperaturę na 95°C.
2. Rozmrozić ependorfówki z zamrożonymi po hodowli próbkami elektroforetycznymi:
   1. Próbka pobrana po 1 godzinie hodowli.
   2. Próbka pobrana po 2 godzinach hodowli.
   3. Próbka pobrana po 3 godzinach hodowli.
   4. Próbka pobrana po 4 godzinach hodowli.
3. Inkubować wszystkie próbki we wrzącej łaźni wodnej lub bloku grzejnym przez 5 min.
4. Zwirować próbki, tak aby opadła na dno ciecz, która skropliła się w czasie inkubacji na zamknięciu ependorfówki
5. Nanieść po 30 μl każdej z próbek do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
6. Do jedenj ze studzienek nanieść marker białkowy otrzymany od asystenta.
7. Zanotować położenie próbek na żelu.
8. Zanotować masy białek wchodzących w skład markera.

Wykonanie elektroforezy

1. Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 100-120 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150-160 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150 V Kontynuować rozdział dopóki barwnik nie znajdzie się 0.5 cm od końca żelu.
2. Po skończonym rozdziale odłączyć napięcie, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu.

Barwienie żelu i dokumentacja

1. Ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i za pomocą szpatułki przenieść do pojemnika.
2. Do pojemnika wlać ostrożnie wodę (200 ml na każdy żel).
3. Płukać przez 5 minut.
4. Przytrzymując żel ręką w rękawiczce wylać wodę z pojemnika.
5. Czynności 2-4 powtórzyc dwukrotnie.
6. Nalać do pojemnika z żelem barwnik (Bio-Safe Coomassie Stain, BioRad) w takiej ilości, aby zakrył żel.
7. Zostawić żel w barwniku na ok. 1 h, delikatnie mieszając.
8. Przytrzymując żel ręką w rękawiczce zlać barwnik spowrotem do pojemnika.
9. Nalać do kuwety ostrożnie wodę i płukać przez 30 minut.
10. Wylać wodę.
11. Nalać świeżą porcję wody i płukać żel na kołysce.
12. Nastepnego dnia po odbarwieniu żeli asystenci wykonują ich fotografie i wysyłają studentom.

IV spotkanie: Oczyszczanie białka etykietowanego ogonem sześciohistydynowym na kolumienkach wirowniczych Ni-NTA

Materiały niezbędne do wykonania ćwiczenia III

• Kolumienki wirownicze Ni-NTA, falkonówki, ependorfówki.
• Bufory dołaczone do zestawu kolumienek wirowniczych:
  1. Bufor do lizy.
  2. Bufor do mycia.
  3. Bufor do elucji.
• 10% roztwór siarczanu streptomycyny.
• Lizozym o stężeniu 10 mg/ml.

Wykonanie oczyszczania

1. Rozmrozić osad zebrany w falkonowce z hodowli bakteryjnej (5 ml).
2. Osad zawiesić w 630 μl buforu do lizy.
3. Dodać 70 μl rotworu lizozymu o stężeniu 10 mg/ml i wymieszać.
4. Inkubować mieszaninę w lodzie 15 – 30 minut.
5. Odwirować zhomogenizowany ekstrakt bakteryjny 15-30 minut przy przyspieszeniu 12000g w temperaturze 4°C.
6. Przenieść supernatant do nowej, oznaczonej ependorfówki umieszczonej w lodzie.
7. Dodać 70 μl 10% (w/v) roztworu siarczanu streptomycyny i delikatnie wymieszać.
8. Zwirować mieszaninę 30 min, 12 000g, 4 °C.
9. Supernatant zawierający białko przenieść do nowej oznaczonej falkonówki.
10. Zrównoważyć kolumienki wirownicze z Ni-NTA buforem do lizy — nalać na kolumienkę 600 ul buforu i wirować przez min. 4 minuty przy 2900 rpm (około 890g).
11. Nałożyć supernatant na zrównoważoną buforem kolumienkę wirowniczą.
12. Zwirować kolumienkę (5 minuty, 1600 rpm = 270g). Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (A).
13. Nalać na kolumienkę 600 ul buforu do mycia i zwirować kolumienkę (2 minuty, 2900 rpm = 890g). Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (B).
14. Powtórzyć czynności opisane w punkcie 14.Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (C).
15. Nałożyc na kolumienkę 300 ul buforu do elucji i zwirować kolumienkę (2 minuty, 2900 rpm = 890g). Zabrać eluat z oczyszczonym białkiem do ependorfówki. Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (D).
16. Powtórzyć czynności opisane w punkcie 16. Zachować eluat do analizy elektroforetycznej w oznaczonej ependorfówce (E).
17. Schować podpisane ependorfówki do zamrażarki.

V spotkanie: Kontrola jakości oczyszczania białka metodą elektroforezy denaturującej (patrz również spotkanie III)

Odczynniki niezbędne do wykonania ćwiczenia III

• Odczynniki do przygotowania żeli:
  • 30% roztwór akrylamidów,
  • woda dejonizowana,
  • TEMED,
  • 10% APS,
  • 1.5 M bufor Tris-HCl, pH 8.8,
  • 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8,
  • 10% SDS;
• barwnik denaturujący do białek (5x stężony),
• bufor glicynowy do elektroforezy SDS-PAGE 1x stężony,
• barwnik do barwienia żelu po elektroforezie (BioRad),
• etanol do mycia szybek elektroforetycznych,
• elektroforetyczny marker białkowy.

Przygotowanie i przeprowadzenie elektroforezy

Przygotowanie żelu poliakrylamidowego

1. Starannie umyć szybki elektroforetyczne wodą, wytrzeć ręcznikiem papierowym i przetrzeć wewnętrzne powierzchnie etanolem.
2. Każda z osób składa ze sobą dwie syzbki.
3. Złożone szybki spiąć klamrami i zamocować na podstawce.
4. Sporządzić roztwór żelu separującego (dolnego) o odpowiednim stężeniu (według Tab.1).
5. Szybko wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego i grzebień.
6. Po wylaniu żelu upewnić się, że nie ma w nim bąbli powietrza.
7. W celu odcięcia dostępu tlenu przeszkadzającego polimeryzacji na żel nalać ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (45 minut).
8. Po spolimeryzowaniu żelu separującego przygotować żel ściągający według Tab.1.
9. Szybko zlać wodę z nad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym.
10. Natychmiast wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do ich górnej granicy. Uważać aby nie powstały pęcherzyki powietrza.
11. Ostroznie włożyć grzebień.
12. Pozostawić do polimeryzacji (30 - 45 minut).

Przygotowanie układu do elektroforezy

1. Zdjąć złożone szybki z żelem z podstawki i wstawić do aparatu do elektroforezy.
2. Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym).
3. Wyjąć ostrożnie grzebień z żelu.
4. Za pomocą pipety automatycznej usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej części żelu.

Przygotowanie i nanoszenie próbek

1. Przygotować łaźnię wodną lub włączyć blok grzejny i nastawić temperaturę na 95°C.
2. Rozmrozić ependorfówki z zamrożonymi po hodowli próbkami elektroforetycznymi.
   1. Eluat w buforze do lizy po nałożeniu białka na kolumnę.
   2. Eluat w buforze do mycia — I.
   3. Eluat w buforze do mycia — II.
   4. Oczyszczone białko po pierwszej elucji.
   5. Oczyszczone białko po drugiej elucji.
3. Po rozmrożeniu pobrać do oznaczonych ependorfówek po 20 [math]\mu[/math]l próbki.
4. Dodać bufor barwiąco-denaturujący (20 [math]\mu[/math]l).
5. Inkubować we wrzącej łaźni wodnej lub bloku grzejnym przez 5 min.
6. Zwirować przygotowane próbki.
7. Nanieść po 30 [math]\mu[/math]l każdej z próbek do studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej.
8. Do jednej ze studzienek nanieść marker otrzymany od asystenta. Marker ma taki sam skład, jak używany na III spotkaniu.
9. Zanotować położenie próbek na żelu.

Wykonanie elektroforezy

1. Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 100-120 V. Po wniknięciu próbek w żel separujący zwiększyć napięcie do 150-160 V.
2. Po skończonym rozdziale odłączyć napięcie, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu.

Barwienie żelu i dokumentacja.

1. Ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i za pomocą szpatułki przenieść do pojemnika
2. Do pojemnika wlać ostrożnie wodę
3. Płukać przez 5 minut.
4. Wylać wodę z pojemnika
5. Czynności 2-4 powtórzyc dwukrotnie
6. Nalać do pojemnika z żelem barwnik.
7. Zostawić żel w barwniku na ok. 15 minut
8. Zlać barwnik do pojemnika
9. Nalać do kuwety ostrożnie wodę i płukać przez 30 minut.
10. Wylać wodę
11. Nalać świeżą porcję wody i płukać żel na kołysce
12. Nastepnego dnia po odbarwieniu żeli asystenci wykonują ich fotografie i wysyła studentom.
13. Po otrzymaniu fotografii żelu należy przeprowadzić jego analizę:
    1. umieścić zdjęcie żelu wraz z opisem,
    2. wyznaczyć ruchliwość względną (Rf) białek wzorcowych,
    3. wykonać wykres zależności drogi migracji od logarytmu masy,
    4. Wyznaczyć masę cząsteczkową białka.

VI spotkanie: Określenie stężenia białka metodą spektrofotometryczną i Bradford

Materiały niezbędne do wykonania ćwiczenia

• Bufor fosforanowy 50 mM pH 8.0,
• 1 M roztwór NaOH,
• odczynnik Bradforda,
• albumina wołowa o stężeniu 1 mg/ml.

Metoda spektrofotometryczna

1. Usunąć imidazol wykonać dwu lub trzykrotna dializę względem buforu fosforanowego 20 mM, pH 8, 200 mM NaCl.
2. Do kuwety nalać 2 ml buforu fosforanowego o pH 8, zmierzyć wartość absorpcji w 280 nm, wynik zapisać
3. Dodać 5 ul próbki oczyszczonego białka i zmierzyć absorpcję.
4. Pomiar powtórzyć trzykrotnie.
5. Wyznaczyć stężenie białka stosując prawo Lamberta-Beera i korzystając z podanej przez asystenta wartości współczynnika ekstynkcji. Dane zapisać w tabeli.

Metoda Bradford

1. Z wyjściowego roztworu surowiczej albuminy bydlęcej o stężeniu 1 mg/ml sporządzić dla całej grupy rozcieńczenia według Tab. Figure 2.
2. Uzyskany zestaw stężeń należy podzielić na ilość osób wykonujących ćwiczenie.

   Stężenie wyjściowego roztworu białka (mg/ml)	Objętość wyjściowego roztworu białka (ml)	Objętość H2O (ml)	Stężenie wzorcowego roztworu białka (mg/ml)	Objętość wzorcowego roztworu białka (ml)
   1	1	0	1	1
   1	0,75	0,25	0,75	1
   1	0,5	0,5	0,5	1
   1	0,25	0,75	0,25	1
   1	0,2	1,8	0,1	2
   0,1	0,75	0,25	0,075	1
   0,1	0,5	0,5	0,05	1
   0,1	0,25	0,75	0,025	1
   0,1	0,1	0,9	0,01	1

3. Do ependorfówek dodać po 0,02 ml roztworów białka wzorcowego o stężeniach: 1; 0,75; 0,5; 0,25; 0,1; 0,075; 0,05; 0,025; 0,01 mg/ml (dwa powtórzenia dla każdego stężenia BSA) i po 0.98 ml odczynnika Bradforda.
4. Do ependorfówek dodać po 0,02 , 0,04 i 0,06 ml próbki białka, której stężenie chcemy ocenić i odpowiednio po 0.98, 0,96 i 0,94 ml odczynnika Bradforda.
5. Całość natychmiast energicznie wymieszać i pozostawić na 5 minut. Równolegle przygotować próbę kontrolną przez zmieszanie 0,02 ml H2O z 0,98 ml odczynnika Bradforda.
6. Wykonać pomiary absorbancji dla wszystkich próbek, łącznie z kontrolną, przy długości fali 595 nm.
7. Wykreślić krzywą wzorcową jako zależność pomiędzy stężeniami białka a wartościami absorbancji.
8. Umieścić na krzywej wzorcowej absorpcję odczytaną w 595 nm dla badanej próbki białka i odczytać stężenie.

Porównać stężenia bialka uzyskane metodą Bradford oraz spektrofotometryczną. Wyniki przedyskutować.