Chromatografia elektroforeza

Zadanie 1

Chromatogram 1 uzyskano metodą chromatografii HPLC (highperformance liquid chromatography) dla próbki będącej mieszaniną dwóch cukrów A i B. Chromatogram 2 uzyskano dla tej samej mieszaniny, ale zastosowano inne warunki HPLC.

Rozważ następujące zmiany warunków, w których uzyskano chromatogram 2:

1. zmniejszenie ciśnienia fazy mobilnej,
2. zmniejszenie temperatury,
3. zastosowanie kolumny o mniejszym stopniu upakowania,

Która z powyższych zmian odpowiada za różnice widoczne między chromatogramami 1 i 2? Odpowiedź uzasadnij.

Zadanie 2

Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATC-aza) to enzym biorący udział w syntezie zasad azotowych z grupy pirymidyn. Posiada niezwykłą budowę podjednostkową, która można określić stosując filtrację żelową (chromatografia typu sita molekularnego) i elektroforezę denaturującą (SDS-PAGE; SDS polyacrylamide gel electrophoresis). Hipotetyczne wyniki zostały zebrane poniżej.

Tabela Figure 1 zawiera listę białek użytych do kalibracji kolumny chromatograficznej, ich masy cząsteczkowe oraz objętości, przy których zostały wymyte z kolumny.

1. Objętość elucji karbamoilotransferazy asparaginianowej na tej kolumnie wynosi 101 ml. Ile wynosi jej masa cząsteczkowa?

   Białko	Masa cząsteczkowa M [g]	Objętość elucji V [ml]
   Cytochrom c	12 400	208
   Mioglobina	17 800	194
   Chymotrypsynogen	25 000	185
   BSA	66 200	152
   Dehydrogenaza mleczanowa	295 000	102
   Apoferrytyna	475 000	90

2. Enzym został poddany działaniu czynnika redukującego mostki disiarczkowe i ponownie przepuszczony przez kolumnę. Tym razem pojawiły się dwa piki, przy objętości 138 i 174 ml. Jakim masom odpowiadają?
3. Następnie przeprowadzono elektroforezę denaturującą enzymu na żelu poliakrylamidowym. Białka przedstawione w tabeli Figure 2 zostały użyte do kalibracji żelu. Na żelu zaobserwowano dwa prążki pochodzące od karbamoilotransferazy w odległości 58 i 82 mm od początku żelu separującego. Jakie masy im odpowiadają?

   Białko	Masa cząsteczkowa M [g]	Odległość d [mm]
   Lizozym	14 400	88
   β-laktoglobulina	18 400	78,2
   Anhydraza węglanowa	29 000	70,0
   Dehydrogenaza mleczanowa	35 000	55,2
   Ovalbumina	45 000	46,0
   BSA	66 200	30,2
   β-galaktozydaza	116 000	10,0

4. Jakie wnioski dotyczące budowy czwartorzędowej karbamoilotransferazy aspartanowej możesz wysnuć na podstawie wyników uzyskanych w pktach a.-c.?

Zadanie 3

Punkt izoelektryczny pewnego białka jest równy wartości pH , w którym przeprowadzana jest elektroforeza natywna. Do której elektrody (do katody czy anody) będzie migrowało to białko?

Zadanie 4

Jak zwiększenie stężenia akrylamidu wpływa na rozmiary porów żelu i rozdział makrocząsteczek pod względem wielkości?

Zadanie 5

Jakiego typu nośnika używa się w przypadku elektroforezy makrocząsteczek o masach większych niż [math]\unit{100\times10^3}{ kDa}[/math] (np. dwuniciowego DNA), które są zbyt duże by penetrować pory żelu poliakrylamidowego?

Zadanie 6

Który z poniższych czynników: pH, siła jonowa, temperatura czy natężenie prądu, mają największy wpływ na rozdział białek w przypadku elektroforezy natywnej? Odpowiedź uzasadnij.