Metody Biofizyki Molekularnej/Wstęp

Celem wykładu „Metody Biofizyki Molekularnej” przeznaczonego dla studentów kierunku „Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie” jest poznanie podstaw metod niespektroskopowych stosowanych przez współczesną fizykę eksperymentalną do badania struktury biocząsteczek oraz procesów zachodzących na poziomie molekularnym.

Po wysłuchaniu wykładu studenci powinni umieć odpowiedzieć na następujące pytania:

• Z punktu widzenia metody:
  • Jakie warunki musi spełniać obiekt, aby można było badać go wiarygodnie wybraną metodą?
  • Jakie są ograniczenia metody?
• Z punktu widzenia obiektu:
  • Czy dana metoda nadaje się do badania wybranego obiektu i czego możemy się o nim dowiedzieć stosując wybrana metodę?

W trakcie wykładu poruszane będą następujące zagadnienia:

• Oczyszczanie i separacja makrocząsteczek:
  • chromatografia,
  • elektroforeza.
• Metody hydrodynamiczne:
  • ultrawirowanie,
  • wiskozymetria.
• Określanie struktur chemicznych i przestrzennych cząsteczek:
  • spektrometria mas,
  • krystalizacja i rentgenografia kryształów.
• Metody termodynamiczne:
  • kalorymetria,
  • osmometria.
• Metody relaksacyjne:
  • zatrzymanego przepływu,
  • perturbacyjne.
• Nanobiologia — obserwacje, spektroskopia i manipulacje pojedynczymi molekułami:
  • mikroskopia optyczna i elektronowa,
  • mikroskopia sil atomowych (AFM),
  • szczypce optyczne i magnetyczne.

Obiektami pomiarów są makrocząsteczki biologiczne nazywane zamiennie makromolekułami, biocząsteczkami lub biopolimerami. Są to związki o masie do kilku milionów daltonów tworzone z podjednostek: białka — z aminokwasów, kwasy nukleinowe — z nukleotydów, polisacharydy — z monosacharydów.

Właściwości makromolekuł jakie wykorzystuje się podczas ich identyfikacji i charakterystyki to:

• powinowactwo do innych molekuł,
• ładunek elektryczny,
• kształt.
• masa,
• hydrofobowość,
• lepkość,
• zdolność krystalizowania.

Przy tworzeniu trójwymiarowych struktur makrocząsteczek takich jak białka i kwasy nukleinowe zasadniczą rolę odgrywają wiązania wodorowe. Są to słabe oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy elektroujemnym atomem (akceptorem), a atomem wodoru, który jest kowalencyjnie połączony z innym atomem elektroujemnym (donorem). W wiązaniu wodorowym wodór pełni rolę mostka łączącego dwa elektroujemne atomy (O,N,P).

Charakterystyczną cechą biocząsteczek jest wąski zakres warunków chemicznych (pH, siła jonowa) i fizycznych (temperatura, ciśnienie) w których pełnia prawidłowo funkcje biologiczne. W związku z tym aby nie uszkodzić w sposób nieplanowany biomolekuł należy uważnie zaplanować pomiary eksperymentalne biorąc pod uwagę wpływ środowiska pomiarowego na stabilność makromolekuł. Należy odpowiedzieć w jakich warunkach najkorzystniej będzie wykonywać pomiary, a więc co wybrać:

• Jaki bufor?
• W jakiej temperaturze pracować?
• Jaka siła jonowa?
• Jakie stężenie białka?
• Czy stosować dodatkowe odczynniki:
  • środki redukujące (beta-merkaptoetanol, DTT),
  • odczynniki utleniające,
  • inhibitory proteaz,
  • odczynniki denaturujące,
  • detergenty jonowe i niejonowe,
  • związki wiążące kwasy nukleinowe?

Planując pomiary, należy umieć oszacować stężenie makromolekuł.

Przypominamy, że:

Masa cząsteczkowa to masa określonej cząsteczki, wyrażona w atomowych jednostkach masy (Da, u) będąca sumą mas atomowych pierwiastków wchodzących w jej skład. Jednostka masy atomowej (u) jest równa 1/12 masy atomu węgla ¹²C [math](\unit 1 {Da},\ u =\unit{1,66\cdot10^{−24}} g)[/math]. Masę cząsteczkową białek podaje się najczęściej w kilodaltonach, np. GFP [math]M=\unit{23}{ kDa}[/math].

Masa molowa to masa jednego mola substancji wyrażona w gramach (gram/mol).

1 mol — liczba cząsteczek równa liczbie atomów zawartych w masie 0.12 kg czystego nuklidu ¹²C. Wynosi ona [math]\unit{6,02\cdot10^{23}}{\frac1{mol}}[/math] (liczba Avogadra N_A) (masa molowa [math]M_m[/math] jest taką liczbą gramów danej substancji, która jest co do wielkości równa jej (względnej) masie cząsteczkowej [math]M_c[/math], wyrażonej w atomowych jednostkach masy)

Masa molowa [g/mol] = średnia masa cząsteczkowa [Da]

Wyznaczanie stężenia białek na podstawie zawartości aminokwasów aromatycznych:

• tryptofanu,
• tyrozyny,
• fenyloalaniny.

Współczynnik ekstynkcji w 280 nm:

• Trp — [math]\unit{5500}{\frac 1{ Mcm}}[/math],
• Tyr — [math]\unit{1490}{\frac 1{ Mcm}}[/math],
• Phe — [math]\unit{125}{\frac 1{ Mcm}}[/math].

[math]\varepsilon_\mathrm{bialka} = N_\mathrm{Tyr}\cdot \varepsilon_\mathrm{Tyr} + N_\mathrm{Trp}\cdot \varepsilon_\mathrm{Trp} + N_\mathrm{Phe}\cdot \varepsilon_\mathrm{Phe}[/math]

prawo Lamberta-Beera

[math]A(C_o)=\varepsilon Cl[/math]

stężenie białka[mol/l]

[math]\frac{A}{\{\unit{\varepsilon_\mathrm{bialka}}{\left[\frac 1{Mcm}\right]} \cdot \unit{l}{[cm]}\}}[/math]

Stężenie procentowe białka:

ilość gramów białka w 100 ml roztworu

np. 1% = 1 g/100 ml = 10 mg/ml.

Stężenie molowe:

ilość moli białka w litrze roztworu (ozn. [M] = [mol/l]).

Procentowy współczynnik ekstynkcji odpowiada absorpcji białka o stężeniu 1% w kuwecie o długości drogi optycznej 1cm. Jednostka [math]\frac 1{\frac {\mathrm g}{100\, \mathrm{ml}}\mathrm{cm}}[/math].

Molowy współczynnik ekstynkcji odpowiada absorpcji 1 M białka w kuwecie o długości drogi optycznej 1 cm. Jednostka [math]\unit{}{\left[\frac 1{M cm}\right]}[/math].

Zależność pomiędzy molowym a procentowym współczynnikiem ekstynkcji:

[math]\varepsilon \cdot \unit{10}{\left[\frac 1{M cm }\right]} = \varepsilon[\%] \cdot[/math] masa molowa białka.

Jeśli nie wiemy nic o białku to przyjmuje się, ze [math]\varepsilon_\mathrm{bialka}[\%]=10[/math]

(dla większości białek [math]\varepsilon[\%]= 4 - 24[/math]).

Przeliczanie stężenia białka z M (czyli mol/l) na mg/ml i odwrotnie:

X [mol/l] X [mol] * masa molowa [g/mol]/l = X [mol] * masa molowa *1000[mg/mol]/1000 ml = X * masa molowa [g] = Y [mg/ml]

Y [mg/ml] Y / masa molowa [g] = X [M].

Celem wielu pomiarów biofizycznych jest m.in. wyznaczenie średniej masy biocząsteczek. Najczęściej spotykamy się z wagowo (masowo) średnią masą cząsteczkowa lub ilościowo (liczbowo) średnią masą cząsteczkową. Definicje tych wielkości są dyskutowane w dalszej części wykładu (osmometria).