Brain-wiki - Wkład użytkownika [pl]

Pracownia Sygnałów Biologicznych/Zajecia 7

2016-05-23T13:52:24Z

Annach: /* Napisz moduł: */

Pomiar Elektrookulogramu
==Wstęp==
Kolejnym narządem, w którym znajdują się generatory czynności bioelektrycznej jest oko. W narządzie tym zachodzą skomplikowane procesy biochemiczne i elektryczne, umożliwiające widzenie. Procesy te zostaną omówione na oddzielnym wykładzie, w tym miejscu zaś wymienimy tylko te zjawiska, które mają wpływ na powstawanie w oku czynności elektrycznej.
# Jednym z najważniejszych części oka jest ''siatkówka'', której zadaniem jest odbieranie bodźców świetlnych oraz zamiana ich na sygnały elektryczne, przekazywane dalej do kory wzrokowej. W siatkówce płynie nieustannie prąd, którego natężenie zmienia się wraz z intensywnością padającego na nią światła. Związane z tym sygnały bioelektryczne można rejestrować za pomocą elektrod umieszczonych na powierzchni oka lub nawet za pomocą elektrod umieszczonych na powierzchni skóry wokół oka. Tak zarejestrowany sygnał elektryczny, powstały w oku w trakcie widzenia, nazywamy ''Elektroretinogramem'' (ERG). Sygnał ten ma amplitudę od kilku nanowoltów do kilku μV i jest wykorzystywany w diagnostyce wielu chorób siatkówki.
# Rogówka (zewnętrzna warstwa oka znajdująca się w jego przedniej części) jest naładowana dodatnio względem siatkówki umiejscowionej po przeciwnej stronie oka. Rogówka wraz z siatkówką tworzą zatem w przybliżeniu układ dipola elektrycznego. W momencie ruchu okiem, dipol ten zmienia orientację w przestrzeni, zaburzając rozkład natężenia pola elektrycznego. Związany z tym sygnał o amplitudzie kilku miliwoltów można zmierzyć za pomocą elektrod umieszczonych na skórze wokół oka. Widoczny jest ona także na elektrodach umieszczonych na powierzchni głowy w trakcie pomiary czynności elektrycznej mózgu. Sygnał ten, czyli elektryczny zapis ruchu gałek ocznych, nazywamy Elektrookulogramem (EOG). Czynność elektryczną związaną z ruchem gałek ocznych obserwuje się również w trakcie mrugania, kiedy to gałki oczne skręcają nieco ku górze (tzw. zjawiska Bella), a także w trakcie badań diagnostycznych zaburzeń snu (w różnych etapach snu występują wolne lub szybkie ruchy gałek ocznych).
Sygnał EOG można też wykorzystać do konstrukcji interfejsów [[http://dl.acm.org/citation.cfm?id=1740647]].
# Ruch oka sterowany jest za pomocą mięśni. W trakcie rejestracji Elektrookulogramu widoczne będą również wyładowania elektryczne związane z działaniem mięśni.
===Ćwiczenie I ===
Wykonaj pomiar Elektrokulogramu za pomocą dwóch par elektrod połączonych w montażu dwubiegunowym.

* Jedną parę elektrod umieść poniżej i powyżej oka, drugą w pobliżu lewej i prawej skroni.
* Skonfiguruj program do rejestracji i przeglądania mierzonego sygnału w czasie rzeczywistym.
* Wykonaj ruch oczami w górę i opisz zarejestrowany sygnał.
* Wykonaj ruch oczami w dół i opisz zarejestrowany sygnał.
* Wykonaj mrugnięcie i opisz zarejestrowany sygnał.
* Przeczytaj fragment tekstu, zaobserwuj efekty związane z ruchem sakadowym oka.
Zarejestruj sygnały w wyżej wymienionych sytuacjach. Wyświetl te sygnały w programie napisanym samodzielnie, bez stosowania filtra grórnoprzepustowego.

===Ćwiczenie II ===
Powtórz ćwiczenie I, łącząc elektrody z monopolarnymi wejściami wzmacniacza, elektrodę odniesienia umieść na lewym płatku uszu lub wyrostku sutkowatym.

===Ćwiczenie III===
Napisz program wyświetlający na macierzy 5x5 następujące sekwencje:
* kwadrat środkowy - kwadrat górny - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat prawy - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat dolny - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat lewy - kwadrat środkowy
Zapisuj do pliku tekstowego czasy i kody poszczególnych sekwencji.

Wyświetl te sygnały w programie napisanym samodzielnie, bez stosowania filtra grórnoprzepustowego.

Zaprojektuj detektor, wykrywający, która sekwencja została wykonana.

===Ćwiczenie IV ===
Zrealizuj prosty system do rejestracji ruchu gałki ocznej, tzw. Eye tracker. w tym celu:
==== Napisz moduł:====
* Korzystając detektora sekwencji napisanego w ramach ćwiczenia III napisz moduł wykrywający sekwencje w czasie rzeczywistym. Niech Twój moduł wypisuje wynik detekcji na konsolę. '''Opis korzystania i pisania modułów do systemu OBCI znajduje się''' [[http://bci.fuw.edu.pl/wiki/Tutorials tutaj]]. W dużym skrócie to co należy zrobić to:

* W katalogu domowym utwórz podkatalog:
~/obci/scenarios
* w katalogu tym umieść plik:
eog.ini
powinien on zawierać następującą treść:
<source lang = 'text'>
[peers]
scenario_dir=
;***********************************************
[peers.mx]
path=multiplexer-install/bin/mxcontrol

;***********************************************
[peers.config_server]
path=control/peer/config_server.py

;***********************************************
;***********************************************
[peers.amplifier]
path = drivers/eeg/cpp_amplifiers/amplifier_tmsi.py
;ponizsza sciezka pokazuje na plik zaierajacy nasze ustawienia parametrow wzmacniacza
config=~/obci/scenarios/eog_local_params.ini

[peers.analysis]
path=~/obci/analysis/eog_realtime.py
config=~/obci/analysis/eog_realtime.ini
</source>
* W powyższym pliku zadeklarowaliśmy, że lokalne parametry dla wzmacniacza znajduję się w pliku:
~/obci/scenarios/eog_local_params.ini
zatem musimy ten plik wytworzyć i wypełnić go np. taką treścią:
<source lang = "text">
[local_params]
channel_names=gora;dol;lewa;prawa
active_channels=0;1;2;3
sampling_rate=256
</source>
* W pliku ze scenariuszem zadeklarowaliśmy też, że nasz moduł analizy danych znajduje się w pliku:
~/obci/analysis/eog_realtime.py
tak więc musimy ten plik stworzyć i tam właśnie wpisać algorytm detekcji. Dla zachowania konwencji w tym samym katalogu powinien znajdować się plik na ewentualne parametry dla modułu eog_realtime.py. Musi on się nazywać tak samo, tyle, że ma rozszerzenie .ini. Musimy więc wytworzyć pusty plik:
~/obci/analysis/eog_realtime.ini
Ponieważ nasz algorytm musi on się komunikować z resztą systemu obci trzeba go opakować w poniższy kod-szkielet:

<source lang = 'python'>
#!/usr/bin/env python
# -*- coding: utf-8 -*-
import random, time, numpy

from multiplexer.multiplexer_constants import peers, types
from obci.control.peer.configured_multiplexer_server import ConfiguredMultiplexerServer
from obci.configs import settings, variables_pb2
from collections import deque

import obci.utils.openbci_logging as logger

#LOGGER = logger.get_logger("sample_analysis", "info")
LOGGER = logger.get_logger("sample_analysis", "debug")

class SampleAnalysis(ConfiguredMultiplexerServer):
"""A class responsible for handling signal message and making proper decision.
The class inherits from generic class for convinience - all technical stuff
is being done in this super-class"""
def __init__(self, addresses):
"""Initialization - super() and ready() calls are required..."""
super(SampleAnalysis, self).__init__(addresses=addresses,
type=peers.ANALYSIS)
self.ready()
LOGGER.info("Sample analysis init finished!")

def handle_message(self, mxmsg):
"""The only required function in the class
that will be fired every time message is received"""
if mxmsg.type == types.AMPLIFIER_SIGNAL_MESSAGE:
# Got proper message, let`s unpack it ...

# Messages are transmitted in bunches so lets define SampleVector
# in order to unpack bunch of Sample messages ...
l_vect = variables_pb2.SampleVector()
l_vect.ParseFromString(mxmsg.message)

# Now we have message unpacked, lets iterate over every sample ...
for s in l_vect.samples:

# Every sample has two fields:
# timestamp - system clock time of a moment of Sample`s creation
# channels - a list of values - one for every channel
LOGGER.debug("Got sample with timestamp: "+str(s.timestamp))

# One can copy samples to numpy array ...

a = numpy.array(s.channels) # w tym miejscu mamy w tablicy a "paczke" próbek (domyślnie 4próbki ) ze wszystkich zadeklarowanych kanalow
#################### TU TRZEBA WPISAC SWOJ KOD BUFOROWANIA i ANALIZY ##############
print a #na dobry poczatek wypiszmy probki

####################################################################

# Or just iterate over values ...
for ch in s.channels:
LOGGER.debug(ch)

# Having a new bunch of values one can fire some magic analysis and
# generate decision ....

# Below we have quite simple decision-maker - it generates a random
# decision every ~100 samples-bunch
########## TU NA PODSTAWIE ANALLIZY PODEJMUJEMY DECYZJE I MOZEMY JA PRZEKAZAC DO RESZTY SYSTEMU OBCI ######################
########## W TYM PRZYKLADZIE JEST TO LOSOWA DECYZJA ##############
########## W TYM CWICZENIU WYSTARCZY JESLI WYPISZECIE DECYZJE NA EKRAN ###########
if random.random() > 0.99:
# Here we send DECISION message somewhere-to-the-system ...
# It's up to scenario's configuration how the decision will be used ...
# Eg. it might be used by LOGIC module to push some button in speller.
self.conn.send_message(message = str(random.randint(0,7)),
type = types.DECISION_MESSAGE,
flush=True)
else:
LOGGER.warning("Got unrecognised message type: "+str(mxmsg.type))

# Tell the system 'I`ll not respond to this message, I`m just receiving'
self.no_response()

if __name__ == "__main__":
# Initialize and run an object in order to have your analysis up and running
SampleAnalysis(settings.MULTIPLEXER_ADDRESSES).loop()

</source>

* Aby uruchomić nasz scenariusz trzeba wywołać:
obci launch ~/obci/scenarios/eog.ini
* Zatrzymanie scenariusza robimy tak:
obci kill eog
W tym momencie komunikaty ze wszystkich modułów wypisywane są na jednej konsoli. Przydatne jest korzystanie z obiektu 'LOGGER' zamiast funkcji 'print' - w konsoli mamy informację o źródle komunikatu i jego czasie.

OpenBCI działa tak, że jeśli w jednym module pojawi się błąd, to wszystkie inne moduły są zamykane, stąd komunikat podobny do poniższego sugeruje, że w którymś module wystąpił błąd. W takim wypadku należy przejrzeć konsolę i wyszukać komunikat błędu. Niezbędne jest ustawienie bufora konsoli na 'nieograniczony' wykonując: Edycja->Preferencje profilu->Przewijanie->Nieograniczone .

====Przetestuj moduł ====
* Umieść elektrody do rejestracji ruchu gałki ocznej jak w ćwiczeniu I i przetestuj działanie modułu. Miłej zabawy :-)

Pracownia Sygnałów Biologicznych/Zajecia 7

2016-05-23T13:51:43Z

Annach:

Pomiar Elektrookulogramu
==Wstęp==
Kolejnym narządem, w którym znajdują się generatory czynności bioelektrycznej jest oko. W narządzie tym zachodzą skomplikowane procesy biochemiczne i elektryczne, umożliwiające widzenie. Procesy te zostaną omówione na oddzielnym wykładzie, w tym miejscu zaś wymienimy tylko te zjawiska, które mają wpływ na powstawanie w oku czynności elektrycznej.
# Jednym z najważniejszych części oka jest ''siatkówka'', której zadaniem jest odbieranie bodźców świetlnych oraz zamiana ich na sygnały elektryczne, przekazywane dalej do kory wzrokowej. W siatkówce płynie nieustannie prąd, którego natężenie zmienia się wraz z intensywnością padającego na nią światła. Związane z tym sygnały bioelektryczne można rejestrować za pomocą elektrod umieszczonych na powierzchni oka lub nawet za pomocą elektrod umieszczonych na powierzchni skóry wokół oka. Tak zarejestrowany sygnał elektryczny, powstały w oku w trakcie widzenia, nazywamy ''Elektroretinogramem'' (ERG). Sygnał ten ma amplitudę od kilku nanowoltów do kilku μV i jest wykorzystywany w diagnostyce wielu chorób siatkówki.
# Rogówka (zewnętrzna warstwa oka znajdująca się w jego przedniej części) jest naładowana dodatnio względem siatkówki umiejscowionej po przeciwnej stronie oka. Rogówka wraz z siatkówką tworzą zatem w przybliżeniu układ dipola elektrycznego. W momencie ruchu okiem, dipol ten zmienia orientację w przestrzeni, zaburzając rozkład natężenia pola elektrycznego. Związany z tym sygnał o amplitudzie kilku miliwoltów można zmierzyć za pomocą elektrod umieszczonych na skórze wokół oka. Widoczny jest ona także na elektrodach umieszczonych na powierzchni głowy w trakcie pomiary czynności elektrycznej mózgu. Sygnał ten, czyli elektryczny zapis ruchu gałek ocznych, nazywamy Elektrookulogramem (EOG). Czynność elektryczną związaną z ruchem gałek ocznych obserwuje się również w trakcie mrugania, kiedy to gałki oczne skręcają nieco ku górze (tzw. zjawiska Bella), a także w trakcie badań diagnostycznych zaburzeń snu (w różnych etapach snu występują wolne lub szybkie ruchy gałek ocznych).
Sygnał EOG można też wykorzystać do konstrukcji interfejsów [[http://dl.acm.org/citation.cfm?id=1740647]].
# Ruch oka sterowany jest za pomocą mięśni. W trakcie rejestracji Elektrookulogramu widoczne będą również wyładowania elektryczne związane z działaniem mięśni.
===Ćwiczenie I ===
Wykonaj pomiar Elektrokulogramu za pomocą dwóch par elektrod połączonych w montażu dwubiegunowym.

* Jedną parę elektrod umieść poniżej i powyżej oka, drugą w pobliżu lewej i prawej skroni.
* Skonfiguruj program do rejestracji i przeglądania mierzonego sygnału w czasie rzeczywistym.
* Wykonaj ruch oczami w górę i opisz zarejestrowany sygnał.
* Wykonaj ruch oczami w dół i opisz zarejestrowany sygnał.
* Wykonaj mrugnięcie i opisz zarejestrowany sygnał.
* Przeczytaj fragment tekstu, zaobserwuj efekty związane z ruchem sakadowym oka.
Zarejestruj sygnały w wyżej wymienionych sytuacjach. Wyświetl te sygnały w programie napisanym samodzielnie, bez stosowania filtra grórnoprzepustowego.

===Ćwiczenie II ===
Powtórz ćwiczenie I, łącząc elektrody z monopolarnymi wejściami wzmacniacza, elektrodę odniesienia umieść na lewym płatku uszu lub wyrostku sutkowatym.

===Ćwiczenie III===
Napisz program wyświetlający na macierzy 5x5 następujące sekwencje:
* kwadrat środkowy - kwadrat górny - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat prawy - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat dolny - kwadrat środkowy
* kwadrat środkowy - kwadrat lewy - kwadrat środkowy
Zapisuj do pliku tekstowego czasy i kody poszczególnych sekwencji.

Wyświetl te sygnały w programie napisanym samodzielnie, bez stosowania filtra grórnoprzepustowego.

Zaprojektuj detektor, wykrywający, która sekwencja została wykonana.

===Ćwiczenie IV ===
Zrealizuj prosty system do rejestracji ruchu gałki ocznej, tzw. Eye tracker. w tym celu:
==== Napisz moduł:====
* Korzystając detektora sekwencji napisanego w ramach ćwiczenia III napisz moduł wykrywający sekwencje w czasie rzeczywistym. Niech Twój moduł wypisuje wynik detekcji na konsolę. '''Opis korzystania i pisania modułów do systemu OBCI znajduje się''' [[http://bci.fuw.edu.pl/wiki/Tutorials tutaj]]. W dużym skrócie to co należy zrobić to:

* W katalogu domowym utwórz podkatalog:
~/obci/scenarios
* w katalogu tym umieść plik:
eog.ini
powinien on zawierać następującą treść:
<source lang = 'text'>
[peers]
scenario_dir=
;***********************************************
[peers.mx]
path=multiplexer-install/bin/mxcontrol

;***********************************************
[peers.config_server]
path=obci_control/peer/config_server.py

;***********************************************
;***********************************************
[peers.amplifier]
path=drivers/eeg/c_tmsi_amplifier/amplifier_tmsi.py
;ponizsza sciezka pokazuje na plik zaierajacy nasze ustawienia parametrow wzmacniacza
config= ~/obci/scenarios/eog_local_params.ini
[peers.analysis]
path=~/obci/analysis/eog_realtime.py
</source>
* W powyższym pliku zadeklarowaliśmy, że lokalne parametry dla wzmacniacza znajduję się w pliku:
~/obci/scenarios/eog_local_params.ini
zatem musimy ten plik wytworzyć i wypełnić go np. taką treścią:
<source lang = "text">
[local_params]
channel_names=gora;dol;lewa;prawa
active_channels=0;1;2;3
sampling_rate=256
</source>
* W pliku ze scenariuszem zadeklarowaliśmy też, że nasz moduł analizy danych znajduje się w pliku:
~/obci/analysis/eog_realtime.py
tak więc musimy ten plik stworzyć i tam właśnie wpisać algorytm detekcji. Dla zachowania konwencji w tym samym katalogu powinien znajdować się plik na ewentualne parametry dla modułu eog_realtime.py. Musi on się nazywać tak samo, tyle, że ma rozszerzenie .ini. Musimy więc wytworzyć pusty plik:
~/obci/analysis/eog_realtime.ini
Ponieważ nasz algorytm musi on się komunikować z resztą systemu obci trzeba go opakować w poniższy kod-szkielet:

<source lang = 'python'>
#!/usr/bin/env python
# -*- coding: utf-8 -*-
import random, time, numpy

from multiplexer.multiplexer_constants import peers, types
from obci.control.peer.configured_multiplexer_server import ConfiguredMultiplexerServer
from obci.configs import settings, variables_pb2
from collections import deque

import obci.utils.openbci_logging as logger

#LOGGER = logger.get_logger("sample_analysis", "info")
LOGGER = logger.get_logger("sample_analysis", "debug")

class SampleAnalysis(ConfiguredMultiplexerServer):
"""A class responsible for handling signal message and making proper decision.
The class inherits from generic class for convinience - all technical stuff
is being done in this super-class"""
def __init__(self, addresses):
"""Initialization - super() and ready() calls are required..."""
super(SampleAnalysis, self).__init__(addresses=addresses,
type=peers.ANALYSIS)
self.ready()
LOGGER.info("Sample analysis init finished!")

def handle_message(self, mxmsg):
"""The only required function in the class
that will be fired every time message is received"""
if mxmsg.type == types.AMPLIFIER_SIGNAL_MESSAGE:
# Got proper message, let`s unpack it ...

# Messages are transmitted in bunches so lets define SampleVector
# in order to unpack bunch of Sample messages ...
l_vect = variables_pb2.SampleVector()
l_vect.ParseFromString(mxmsg.message)

# Now we have message unpacked, lets iterate over every sample ...
for s in l_vect.samples:

# Every sample has two fields:
# timestamp - system clock time of a moment of Sample`s creation
# channels - a list of values - one for every channel
LOGGER.debug("Got sample with timestamp: "+str(s.timestamp))

# One can copy samples to numpy array ...

a = numpy.array(s.channels) # w tym miejscu mamy w tablicy a "paczke" próbek (domyślnie 4próbki ) ze wszystkich zadeklarowanych kanalow
#################### TU TRZEBA WPISAC SWOJ KOD BUFOROWANIA i ANALIZY ##############
print a #na dobry poczatek wypiszmy probki

####################################################################

# Or just iterate over values ...
for ch in s.channels:
LOGGER.debug(ch)

# Having a new bunch of values one can fire some magic analysis and
# generate decision ....

# Below we have quite simple decision-maker - it generates a random
# decision every ~100 samples-bunch
########## TU NA PODSTAWIE ANALLIZY PODEJMUJEMY DECYZJE I MOZEMY JA PRZEKAZAC DO RESZTY SYSTEMU OBCI ######################
########## W TYM PRZYKLADZIE JEST TO LOSOWA DECYZJA ##############
########## W TYM CWICZENIU WYSTARCZY JESLI WYPISZECIE DECYZJE NA EKRAN ###########
if random.random() > 0.99:
# Here we send DECISION message somewhere-to-the-system ...
# It's up to scenario's configuration how the decision will be used ...
# Eg. it might be used by LOGIC module to push some button in speller.
self.conn.send_message(message = str(random.randint(0,7)),
type = types.DECISION_MESSAGE,
flush=True)
else:
LOGGER.warning("Got unrecognised message type: "+str(mxmsg.type))

# Tell the system 'I`ll not respond to this message, I`m just receiving'
self.no_response()

if __name__ == "__main__":
# Initialize and run an object in order to have your analysis up and running
SampleAnalysis(settings.MULTIPLEXER_ADDRESSES).loop()

</source>

* Aby uruchomić nasz scenariusz trzeba wywołać:
obci launch ~/obci/scenarios/eog.ini
* Zatrzymanie scenariusza robimy tak:
obci kill eog
W tym momencie komunikaty ze wszystkich modułów wypisywane są na jednej konsoli. Przydatne jest korzystanie z obiektu 'LOGGER' zamiast funkcji 'print' - w konsoli mamy informację o źródle komunikatu i jego czasie.

OpenBCI działa tak, że jeśli w jednym module pojawi się błąd, to wszystkie inne moduły są zamykane, stąd komunikat podobny do poniższego sugeruje, że w którymś module wystąpił błąd. W takim wypadku należy przejrzeć konsolę i wyszukać komunikat błędu. Niezbędne jest ustawienie bufora konsoli na 'nieograniczony' wykonując: Edycja->Preferencje profilu->Przewijanie->Nieograniczone .

====Przetestuj moduł ====
* Umieść elektrody do rejestracji ruchu gałki ocznej jak w ćwiczeniu I i przetestuj działanie modułu. Miłej zabawy :-)

Laboratorium EEG/CSP

2016-04-22T07:50:58Z

Annach: /* Przygotowanie scenariuszy obci */

[[Laboratorium_EEG]]/BSS
=Ślepa separacja źródeł=
Rozważmy N - kanałowy sygnał EEG.
Próbkę tego sygnału możemy przedstawić jako punkt w przestrzeni rozpiętej przez osie, z których każda reprezentuje wartość potencjału w jednym kanale. Cały sygnał tworzy w tej przestrzeni chmurę punktów. Rozciągłość tej chmury w danym kierunku mówi nam o wariancji (zmienności) sygnału w tym kierunku.

Taki zbiór punktów wygodniej jest analizować w układzie współrzędnych zgodnym z osiami głównymi macierzy kowariancji.
W dalszej części rozważań założymy, że te przestrzenie, w których rozważamy sygnały są przestrzeniami wektorowymi, a pojedyncze próbki wielokanałowego sygnału są wektorami.
[[Plik:Kowariancja.png|200px|center]]

==Filtry przestrzenne i ślepa separacja źródeł==
Sygnał EEG jest superpozycją aktywności elektrycznej wielu źródeł.
Jak można estymować aktywność samych źródeł?
[[Plik:Mieszanie.png|200px|center]]
Niech:
: <math>s(t)</math> - aktywność niezależnych źródeł,
: <math>x(t)</math> mierzony sygnał
: <math>A</math> macierz przejścia taka, że:
::<math>x(t) = A s(t)</math> (*)
:<math>s(t) = A^{-1}x(t) = P x(t)</math>
Macierz kowariancji dla sygnałów <math>x(t)</math> estymujemy tak:
:<math> C_x = E[x(t)x(t)^T]</math>
Podstawiając (*) mamy:
:<math> C_x = E[x x^T] = E[As(As)^T] = A E[s s^T] A^T = A C_s A^T</math>
Z założenia, że źródła są niezależne wynika, że macierz <math>C_s</math> jest diagonalna.
Przekształcając powyższe równanie możemy zapisać:
:<math>A^{-1} C_x (A^T)^{-1} = P C_x P^T = C_s</math>
Odwzorowanie <math>P = A^{-1}</math> diagonalizuje macierz <math>C_x</math>.

Powyższe rozumowanie jest słuszne w przypadku gdy mamy do czynienia z sygnałem stacjonarnym, tzn. jego macierz kowariancji jest niezależna od czasu -> caly czas aktywna jest ta sama konfiguracja źródeł niezależnych.
W przypadku gdy tak nie jest to konstrukcję filtra przestrzennego można oprzeć o jednoczesną diagonalizację macierzy kowariancji odpowiadających różnym stanom osoby badanej.

[[Plik:Diagonalizacja.png|200px|center]]

==Common Spatial Pattern ==
===Koncepcja===
Dla ustalenia uwagi możemy myśleć o eksperymencie wywołującym potencjał P300. Mamy w nim dwie sytuacje eksperymentalne. Oznaczmy (<math>T</math> - target) próby, w których pojawił się oczekiwany bodziec, zaś (<math>NT</math> - non-target) gdy pojawił się bodziec standardowy.
Chcielibyśmy znaleźć taki montaż, czyli taką kombinację liniową kanałów, które maksymalizuje stosunek mocy (wariancji) sygnałów rejestrowanych w dwóch rożnych warunkach eksperymentalnych.

===Formalizm===
Metoda ta polega na znalezieniu takiego kierunku <math>w</math> w przestrzeni sygnałów, że sygnał z warunku <math>T</math> rzutowany na ten kierunek ma dużą wariancje a sygnał z warunku <math>NT</math> ma wariancję małą.

Rzutowanie sygnału <math>x(t)</math> na kierunek <math>w</math> odbywa się przez policzenie iloczynu skalarnego dla każdej chwili czasu <math>t</math>:
:<math> s_w(t) = w^T x(t)</math>
Wariancja tego rzutowanego sygnału to:
:<math> \mathrm{var}(s_w) = E[s_w s_w^T] = E[ w^T x (w^T x)^T] = w^T E[x x^T] w = w^T C_x w </math>
Zatem znalezienie właściwego kierunku rzutowania można wyrazić jako szukanie maksimum wyrażenia <math> J(w) </math>(jest to tzw. iloraz Rayleigh'a):
: <math>J(w) = \frac{w^T C_T w}{w^T C_{NT} w} </math>
Ekstremum tego ilorazu można znaleźć poprzez policzenie gradientu <math>J(w)</math> i przyrównanie go do zera:
:<math> \nabla J(w) = \frac{ 1 C_{T} w+w^T C_{T} 1}{w^T C_{NT} w}-\frac{w^T C_{T} w\left( 1 C_{NT} w+w^T C_{NT} 1\right)}{\left(w^T C_{NT} w\right)^2}</math>
ponieważ macierze kowariancji są symetryczne
::<math>\nabla J(w) = \frac{ 1}{w^T C_{NT} w}\left[ C_{T} w+ C_{T}w -\frac{w^T C_{T} w}{w^T C_{NT} w} \left( C_{NT} w+ C_{NT}w \right) \right]</math>
::<math>= \frac{ 2}{w^T C_{NT} w}\left[ C_{T}w -\frac{w^T C_{T} w}{w^T C_{NT} w} C_{NT} w \right]</math>
Przyrównując to wyrażenie do zera dostajemy:
:<math> C_{T}w =\frac{w^T C_{T} w}{w^T C_{NT} w} C_{NT} w </math>
Liczba <math> \lambda = \frac{w^T C_{T} w}{w^T C_{NT} w} C_{NT} w </math> jest uogólnioną wartością własną, zaś <math>w</math> jest uogólnionym wektorem własnym odpowiadającym tej wartości.

Aby znaleźć <math> \lambda</math> i <math>w</math> wystarczy rozwiązać zagadnienie własne. W matlabie możemy w tym celu wykorzystać funkcję <tt>eig</tt>



===Ćwiczenie symulacyjne ===
<source lang = matlab>
% symulowany eksperyment składa się z sinusoidy udającej alfę spoczynkową i
% gausa udającego potencjał wywołany
% źródła te są symulowane niezależnie a potem mieszane przez macierz L
% symulujemy źródła
% s1 - symuluje alfę
% s2 - symuluje "potencjał wywołany" (ERP)

%ustawiamy parametry do symulacji sygnałów
Fs = 100;
T = 1;
t = 0:1/Fs:T-1/Fs;
N_rep = 100;
N_chan = 2;
s = zeros(N_rep,N_chan, length(t));
X = zeros(N_rep,N_chan, length(t));

% filtr przestrzenny - z takimi wagami trzeba wziąść kanały EEG aby odzyskać sygnały źródłowe
P = [1 2
1.5 1.3];

% topografie - z takimi wagami źródła dokładają się do poszczególnych elektrod
A = P^(-1);

for r =1:N_rep % tworzymy kolejne realizacje "eksperymentu"
s1 = sin(2*pi*11*t +pi/2+ 0*2*pi*rand())+ 0.02*randn(size(t)); % źródło alfa
s2 = exp(-((t-0.8)/0.05).^2)+ 0.01*randn(size(t)); % źródło ERP

s(r,1,:) = s1;
s(r,2,:) = s2;
tmp = squeeze(s(r,:,:));
n = 0*randn(size(tmp));
X(r,:,:) = A*tmp +n; % rzutujemy sygnały źródłowe na elektrody s -> x

end

% wycinamy warunki
% baseline_ind to indeksy pierwszej połowy każdego powtórzenia "baseline"
% ERP_ind to indeksy drugiej połowy każdego powtórzenia zawierająca "ERP"
baseline_ind = find(t<0.5);
ERP_ind = find(t>=0.5);

x_baseline_kan_1 = X(:,1,baseline_ind);
x_baseline_kan_2 = X(:,2,baseline_ind);

x_ERP_kan_1 = X(:,1,ERP_ind);
x_ERP_kan_2 = X(:,2,ERP_ind);

% liczymy średnie macierze kowariancji:
R_E = zeros(N_chan,N_chan);
R_B = zeros(N_chan,N_chan);
for r =1:N_rep
B = squeeze(X(r,:,baseline_ind));
R_B = R_B + B*B' ;

E = squeeze(X(r,:,ERP_ind));
R_E = R_E + E*E' ;
end

R_B = R_B/N_rep;
R_E = R_E/N_rep;

% rozwiązujemy uogólnione zagadnienie własne
[W,Lambda]=eig(R_E,R_B); % możliwa jest też otymalizacja wzg. średniej macierzy kowariancji (R_B+R_A)/2);

% odzyskujemy sygnały źródeł
for r =1:N_rep
S(r,:,:) = W'*squeeze(X(r,:,:));
end

% pobieramy wycinki odpowiadające obu częściom eksperymentu z estymowanych
% źródeł
s_baseline_estymowany_kan1 = squeeze( S(:,1,baseline_ind));
s_baseline_estymowany_kan2 = squeeze( S(:,2,baseline_ind));

s_ERP_estymowany_kan1 = squeeze(S(:,1,ERP_ind));
s_ERP_estymowany_kan2 = squeeze(S(:,2,ERP_ind));

%%%%%%%%%%%%%% Iloustracje %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
% ilustracja sygnałów mierzonych
figure(1);clf
subplot(2,2,1);
plot(t(baseline_ind),(squeeze(X(:,1,baseline_ind)))','b'); hold on
plot(t(ERP_ind),(squeeze( X(:,1,ERP_ind)))','r'); hold off
xlabel('elektroda 1')
title('ilustracja sutuacji pomiarowej -\newline znane są potencjały na elektrodach w dwóch warunkach eksperymentalnych')
subplot(2,2,3);
plot(t(baseline_ind),(squeeze(X(:,1,baseline_ind)))','b'); hold on
plot(t(ERP_ind),(squeeze( X(:,2,ERP_ind)))','r'); hold off
xlabel('elektroda 2')
subplot(1,2,2)
plot(x_baseline_kan_1(:),x_baseline_kan_2(:),'b.');
hold on
plot(x_ERP_kan_1(:),x_ERP_kan_2(:),'r.');
xlim([-2,2])
ylim([-2,2])
axis equal

% wektor własny odpowiadajacy największej wartości własnej jest
% kierunkiem najbardziej różnicującym warunki eksperymentalne
disp('wartości własne znajdują się na diagonali macierzy Lambda')
disp(Lambda)
% rysujemy wersory jednostkowe w kierunkach wektorów własnych
w1 = W(:,1);
w1 = w1/norm(w1);
w2 = W(:,2);
w2 = w2/norm(w2);
line([0, w1(1) ],[0,w1(2)],'Color',[0,0.3,0])
text(w1(1),w1(2),'wektor własny1')
line([0, w2(1) ],[0,w2(2)],'Color',[1,0,1])
text(w2(1),w2(2),'wektor własny2')

xlabel('Amplituda na elektrodzie 1')
ylabel('Amplituda na elektrodzie 2')
legend('baseline','ERP')

% Ilustracja estymowanych źródeł
figure(2);clf
subplot(2,2,1);
plot(t(baseline_ind),(squeeze(S(:,1,baseline_ind)))','b');hold on
plot(t(ERP_ind),(squeeze(S(:,1,ERP_ind)))','r');hold off
xlabel('estymowane zrodlo 1')
title('ilustracja estymacji -\newline estymowane są potencjały żródeł w dwóch warunkach eksperymentalnych')
subplot(2,2,3);
plot(t(baseline_ind),(squeeze(S(:,2,baseline_ind)))','b');hold on
plot(t(ERP_ind),(squeeze(S(:,2,ERP_ind)))','r');hold off
xlabel('estymowane zrodlo 2');
subplot(1,2,2)
plot(s_baseline_estymowany_kan1(:),s_baseline_estymowany_kan2(:),'b.');
hold on
plot(s_ERP_estymowany_kan1(:),s_ERP_estymowany_kan2(:),'r.');

xlabel('Amplituda estym. źródła 1')
ylabel('Amplituda estym. źródła 2')
legend('baseline','ERP')
</source>

==Zastosowanie filtra CSP do detekcji potencjału P300==
===Eksperyment===
====Przygotowanie do badania:====
* założyć czepek z elektrodami w systemie 10-20
* elektrody referencyjne: M1 i M2
* elektroda GND w pozycji AFz

====Przygotowanie scenariuszy obci ====
* w terminalu uruchomić <tt>obci srv</tt>
* w terminalu uruchomić <tt>obci_gui --preset brain2013</tt>
* w interfejsie GUI zapisujemy scenariusze do własnego katalogu np "P300"
**"P-Brain2013 Signal (with ID)" jako np. "Sygnal"
** "P-Brain2013 Calibration p300 " jako "kalibracjaP300"
** "P-Brain 2013 p300" jako Labirynt
* w przeglądarce plików otwórz katalog ~/.obci/scenarios/P300. Powinien on zawierać pliki: Sygnal.ini, kalibracjaP300.ini, Labirynt.ini oraz katalogi Sygnal_configs, kalibracjaP300_configs, Labirynt_configs.
* edytujemy parametry peerów.
** z katalogu "~/.obci/scenarios/P300/Sygnal_configs" kopiujemy plik "amplifier.ini" do katalogu "~/.obci/scenarios/P300" jako "global_amplifier.ini" . To pozwoli nam zmieniać ustawienia wzmacniacza dla wszystkich scenariuszy jednocześnie.
** w naszych scenariuszach zapisanych w plikach Sygnal.ini, kalibracjaP300.ini, Labirynt.ini podmieniamy ścieżkę <tt>config =</tt> w sekcji <tt>[peers.amplifier]</tt> tak aby
pokazywała na ten skopiowany plik "global_amplifier.ini"
** w tym pliku "global_amplifier.ini" podmieniamy linijki (tak aby były to listy faktycznie wykorzystywanych kanałów) z:
*** active_channels
*** channel_names
** dodajemy też linijkę: sampling_rate = 256
* wchodzimy po kolei do katalogów: Sygnal_configs, kalibracjaP300_configs, Labirynt_configs i odnajdujemy plik <tt>switch_backup.ini</tt>. W tym pliku ustawiamy parametr <tt>new_scenario</tt> na pusty. To spowoduje, że scenariusze te nie będą uruchamiać kolejnych scenariuszy po zakończeniu działania.
** edytujemy plik "~/.obci/scenarios/P300/kalibracjaP300_configs/clasifier.ini"
*** zmieniamy linię
:: ignore_channels = DriverSaw;AmpSaw;PO7;PO8
:: na
:: ignore_channels = DriverSaw;AmpSaw;A1;A2
::* oraz linię:
:: montage_channels = PO7;PO8
:: na
:: montage_channels = A1;A2

====Przeprowadzenie badania:====
# Uruchom scenariusz "Sygnał"
# Tworzy on w katalogu domowym plik o nazwie <tt>file_id_name</tt>.
# Uruchamiamy svaroga z terminala poleceniem <tt>svarog</tt>. W zakładce sygnały on-line odnajdujemy nazwę naszego scenariusza "Sygnal". Podłączamy się do niego i poprawiamy ewentualnie źle kontaktujące elektrody.
# Jak już jesteśmy zadowoleni z jakości sygnału to zatrzymujemy scenariusz "Sygnal" w obci.
# W pliku <tt>file_id_name</tt> znajduje się string, który stanowi rdzeń do tworzenia nazw plików, z których korzystają nasze scenariusze. Proszę zmienić ten string np. na: "test1"
# Uruchamiamy scenariusz "kalibracjaP300". Badany będzie oglądał interfejs z trzema literami A B C migającymi w losowej kolejności. Zadaniem jest zliczanie mignięć litery B.
# Po zakończeniu kalibracji uruchamiamy scenariusz Labirynt.
# Danych z kalibracji potrzebować będziemy kilka zestawów. Proszę powtórzyć kilku krotnie scenariusz kalibracjaP300. Przed każdym uruchomieniem trzeba zmienić string w pliku <tt>file_id_name</tt> np na "test???" gdzie ??? oznacza kolejne numery.

===Analiza wstępna===
* Wczytać dane kalibracyjne do Matlaba i pociąć je na realizacje typu T- target (związane z wystąpieniami litery "B") i NT- non-target (pozostałe litery) o długości -200 do +800 ms wokół trigerów. Dla każdej realizacji odjąć trend liniowy.
* Sygnał zmontować wzg. "średnich uszu" i wyświetlić średnie przebiegi dla warunku T i NT w układzie topograficznym - wykorzystać w tym celu funkcję <tt>topoplot</tt> z pakietu <tt>eeglab</tt>

Poniżej zaprezentowany jest przykładowy skrypt do cięcia danych wokół znaczników. Działa on z plikami zawartymi w archiwum:
: [[Plik:KalibracjaP300.tar.gz]]
Korzysta z funkcji pomocniczych dostępnych w dystrybucji obci w katalogu
: obci/analysis/matlab_obci_signal_processing
Openbci można pobrać z https://github.com/BrainTech/openbci

<source lang = matlab>
% ustalamy nzawy plików z danymi
nazwaPliku = 'p_6301423_calibration_p300.obci';
nameOfXMLFile = strcat(nazwaPliku,'.xml');
nameOfTagFile = strcat(nazwaPliku,'.tag'); %tagi = znaczniki zdarzeń
namesOfDataFiles = strcat(nazwaPliku,'.raw');

% inicjujemy obiekt rm
rm = ReadManager(nameOfXMLFile,namesOfDataFiles,nameOfTagFile);

% obieramy przydatne parametry i znaczniki
numberOfChannels = rm.get_param('number_of_channels');
namesOfChannels = rm.get_param('channels_names');
samplingFrequency = rm.get_param('sampling_frequency');
tagsStruct = rm.get_tags();

% tworzenie list znaczników Target i NonTarget
numberOfStruct = length(tagsStruct);
targetTimeStamps = [];
NonTargetTimeStamps = [];
for structNumber = 1:numberOfStruct % iterujemy się przez tagi
if(strcmp(tagsStruct(structNumber).name,'blink')) % szukamy tagów o nazwie 'blink'
index = tagsStruct(structNumber).children.index; % tu jest numer pola stymulacji
target= tagsStruct(structNumber).children.target;% tu jest numer pola na którym wyświetlany jest target
if index == target % warunek na to, że mamy do czynienia z tagiem target
targetTimeStamps = [targetTimeStamps tagsStruct(structNumber).start_timestamp]; %dodajemy timeStamp do listy targetów
else
NonTargetTimeStamps = [NonTargetTimeStamps tagsStruct(structNumber).start_timestamp];%dodajemy timeStamp do listy non-targetów
end

end
end

% pobieramy próbki
samples = double(rm.get_samples()); % konwersja na double jest potrzebna żeby dobrze funkcjonowało filtrowanie
samples=samples(1:8,:); % odrzucamy kanały, które nie mają EEG
numberOfChannels =8;

% filtrujemy dolnoprzepustowo aby odrzucić artefakty sieci i część
% artefaktów mięśniowych
[b,a] = cheby2(6,80,25 /(samplingFrequency/2),'low');
for ch = 1:numberOfChannels
samples(ch,:)=filtfilt(b,a,samples(ch,:));
end

% montujemy dane do wspólnej średniej (common average)
M = -ones(8,8)/8;
M=M+eye(8,8)*9/8;
samples = 0.0715*M*samples;

% wycinamy dane wokół znaczników
PRE = -0.2; % czas przed tagiem w sek.
POST = 0.8; % czas po tagu w sek.
wycinek = floor(PRE*samplingFrequency:POST*samplingFrequency); % tablica ze "standardowymi' indeksami do cięcia

% pobieramy targety
TargetSignal = zeros(length(targetTimeStamps),numberOfChannels, length(wycinek)); % tablica na sygnały target
for trialNumber = 1:length(targetTimeStamps)
trigerOnset = floor(targetTimeStamps(trialNumber)*samplingFrequency);
tenWycinek = wycinek + trigerOnset;
if tenWycinek(1)>0 && tenWycinek(end)<=size(samples,2) % test czy wycinek który chcemy pobrać nie wystaje poza dostępny sygnał
tmpSignal = samples(:,tenWycinek);
tmpSignal = detrend(tmpSignal')'; % usuwanie liniowego trendu - przy krótkich wycinkach działa lepiej niż filtrowanie górnoprzepustowe
TargetSignal(trialNumber, :,:) = tmpSignal;
end
end

% pobieramy non-targety
NonTargetSignal = zeros(length(NonTargetTimeStamps),numberOfChannels, length(wycinek));% tablica na sygnały non-target
for trialNumber = 1:length(NonTargetTimeStamps)
trigerOnset = floor(NonTargetTimeStamps(trialNumber)*samplingFrequency);
tenWycinek = wycinek + trigerOnset;
if tenWycinek(1)>0 && tenWycinek(end)<=size(samples,2)
tmpSignal = samples(:,tenWycinek);
tmpSignal = detrend(tmpSignal')';
NonTargetSignal(trialNumber, :,:) = tmpSignal;
end
end
%
% dla ilustracji podglądamy średnie po powtórzeniach ze wszystkich targetó∑
% i non-targetów
plot(squeeze(mean(TargetSignal,1))','r');
hold on
plot(squeeze(mean(NonTargetSignal,1))','b')
</source>

===Analiza CSP===
* Korzystając z danych kalibracyjnych wykonac analizę CSP wzmacniającą potencjał P300.
* Zaprezentować średnią ze wszystkich kanałów źródłowych z warunku target (jeden kolor) i non-target (inny kolor) w subplotach ułożonych w prostokątnej siatce. Zaobserwować dla którego kanału średnie różnią się najbardziej. Czy jest związek tego kanału z wartościami własnymi?

* Dla kanału najbardziej różnicującego wykonać mapki topograficzne wektorów odpowiadających:
** filtrowi przestrzennemu
** rzutu topograficznego źródła na elektrody.
* Do wykonania tych mapek wykorzystać funkcję <tt>topoplot</tt> z pakietu <tt>eeglab</tt>
* Zbadać powtarzalność topografii pomiędzy plkiami konfiguracyjnymi.

===Wybór i separacja cech===

==Filtry przestrzenne dla większej ilości warunków==
===FFDIAG===
===Analiza ERD/S z użyciem FFDIAG===

==Filtry przestrzenne dla SSEP ==

=== Teoria===
Proszę zapoznać się z koncepcją filtra przestrzennego dla SSVEP zaprezentowaną tu: http://www.eurasip.org/Proceedings/Eusipco/Eusipco2009/contents/papers/1569193209.pdf

===Eksperyment ASSR===
W eksprymencie wykorzystujemy układ do generacji potencjałów słuchowych stanu ustalonego (ASSR). Wejście układu ASSR typu mini-jack wkładamy w wyjście słuchawkowe w laptopie. Drugie wejście układu ASSR wkładamy do wyjścia triggera we wzmacniaczu. Uruchamiamy plik dźwiękowy MM40tr.wav. Można go znalezc w: http://www.fuw.edu.pl/~suffa/LabEEG/MM40tr.wav

Stymulacja dźwiękowa składa sie z fali nośnej o częstości 400 Hz modulowanej z częstością 40 Hz. Plik dźwiękowy zawiera 5 sekund ciszy i 5 sekund stymulacji, powtórzone 40 razy.

====Rejestracja sygnału====
# Zakładamy czepek i elektrody w systemie 10-10, dbamy o to by opory pomiędzy elektrodami były poniżej 5 k G i różnice pomiędzy oporami różnych elektrod nie przekraczały 20%.
# Oklejamy kwadrat 3x3 elektrod na korze słuchowej z lewej strony (elektrody FT7, FC5, FC3, T7, C5, T3, TP7, CP5, CP3), 3x3 elektrod na korze słuchowej z prawej strony (elektrody FT8, FC6, FC4, T8, C6, T4, TP8, CP6, CP4), elektrody Fz, Cz, Pz i Oz, elektrody referencyjne A1 i A2. W sumie powinno byc 24 elektrody.
# Elektrodę GND mocujemy na pozycji AFz.
# Sygnał rejestrujemy z częstością 2048 Hz.
# Do rejestracji stosujemy scenariusz 'ASSR' w interfejsie obci_gui

====Analiza====
JZ: zmieniłbym analizę na czas-częstość i zrobił porównanie montażu usznego do filtra G.G. Moliny

Początek stymulacji dźwiękowej oznaczymy jako 0. Poniższą analizę zastosuj dla sygnałów w referencji do uśrednionych odprowadzeń usznych A1 i A2.
Wyznaczenie pasma częstości odpowiedzi ASSR
# Z sygnału wycinamy fragmenty od 0 do 5 sek. dla wszystkich elektrod położone nad korą słuchową.
# Dla każdej realizacji obliczamy widma metodą Welcha.
# Otrzymane zespolone widma uśredniamy po realizacjach.
# Sprawdzamy czy w uśrednionym widmie występuję maksimum w częstości modulacji tj. 40 Hz.

====Wyznaczenie przebiegu czasowego ERD i ERS====
# Zaprojektuj filtry pasmowo przepustowe (Chebyszewa 2 rodzaju) zgodne z wyznaczonym pasmem. Zbadaj funkcje przenoszenia i odpowiedzi impulsowej.
# Powycinaj sygnały od -5 do +10 sekund (wszystkie kanały). Przefiltruj każdą realizację.
# Oblicz moc chwilową za pomocą transformaty Hilberta (kwadrat modułu transformaty Hilberta).
# Uśrednij moc chwilową po realizacjach.
# Oblicz względną zmianę mocy chwilowej względem czasu -4 do -2. W ten sposób otrzymasz przebieg ERD i ERS w czasie.
# Wykreśl ERD i ERS w układzie topograficznym. (Rozmieść subploty tak, aby z w przybliżeniu odpowiadały pozycjom elektrod).
====Transformacja Hjortha====
Transformacja Hjortha jest przybliżeniem numerycznym transformacji Laplace'a, czyli drugiej pochodnej przestrzennej. Obliczamy ją jako różnicę potencjału pomiędzy daną elektrodą i średnią z czterech sąsiednich elektrod.
Przelicz potencjały z elektrod, w których występuję odpowiedź ASSR na montaż Hjortha i powtórz analizę ERD/ERS opisaną powyżej.

==ICA jako filtr przestrzenny==

Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych/Ćw 4/I

2015-05-22T14:06:17Z

Annach: /* Literatura: */

'''Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej'''

dr Beata Wielgus-Kutrowska
==Wstęp==

W każdej komórce znajdują się tysiące różnorodnych białek o wyspecjalizowanych funkcjach współpracujących ze sobą. Należą do nich enzymy, białka strukturalne, transportujące, motoryczne, zapasowe, sygnałowe, receptorowe, białka regulujące geny i wiele innych, specyficznych dla konkretnego organizmu i warunków w jakich żyje (np. zapobiegające zamarzaniu ryb). Pomimo tak różnorodnych funkcji, wszystkie białka zbudowane są z takich samych aminokwasów (jest ich około 20). To czym się różnią to kolejności aminokwasów w łańcuchu białkowym, jego długość i struktura przestrzenna makrocząsteczki aktywnej biologicznie. Struktura trójwymiarowa biomolekuły ma fundamentalne znaczenie. Dopiero po jej przyjęciu białko może prawidłowo pełnić swoją funkcję. Natomiast jeśli po utworzeniu, w procesie ekspresji, odpowiedniego łańcucha białkowego, nie dojdzie do jego właściwego skręcenia staje się ono bezużyteczne, a czasem toksyczne dla organizmu. Dobrym przykładem są priony, które występują powszechnie w każdym organizmie i są niegroźne dopóki nie zmienią konformacji, stając się białkiem prionowym infekcyjnym. Priony toksyczne i niegroźne mają identyczną strukturę pierwszorzędową, ale różnią się strukturą drugorzędową (białko PrPC nie wywołujące choroby posiada trzy α-helisy i dwie tzw. β-nici, a patogenne białko PrPSc zawiera przewagę struktury harmonijki β), co wiąże się z odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi — PrPC jest rozpuszczalne w wodzie, natomiast PrPSc jest nierozpuszczalne.

Tak więc aby białka pełniły prawidłowo swoją rolę muszą przybrać właściwą konformację przestrzenną. Pomimo ogromnej różnorodności konformacji białek, można znaleźć pewne cechy wspólne. Jest to tak zwana struktura drugorzędowa, wśród której najczęściej występującymi elementami są β-kartki, α-helisy i fragmenty nieustrukturyzowane (z dokładnym omówieniem tych struktur spotkali się Państwo na wcześniejszych wykładach).

Prawidłowy przebieg procesu przyjmowania właściwej konformacji przestrzennej (proces zwijania, fałdowania, ang. ''folding'') decyduje o tym, czy białko będzie pełnić swoje funkcje. Nic więc dziwnego, że zwijanie białek jest jednym z kluczowych procesów badanych obecnie przez różnorodne zespoły naukowe, wykorzystujące zaawansowane techniki biofizyczne, takie jak spektroskopia (absorpcyjna, emisyjna, dichroizmu kołowego), różnicowa kalorymetria skanująca, spektrometria masowa i inne.

Trzy spośród 20 aminokwasów budujących białka posiadają właściwości emisyjne. Są to tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna. Jednak tylko tryptofan reaguje zmianą intensywności emisji i przesunięcia jej maksimum na zmianę otoczenia, występującą w trakcie zwijania białka, a związaną z przesuwaniem się tryptofanu ze środowiska wodnego, hydrofilowego, do hydrofobowego we wnętrzu cząsteczki (patrz również opis ćwiczenia [[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki). Wykonawszy pomiary zmiany intensywności emisji białka, możemy uzyskać informacje na temat etapów zwijania i ustalić, czy jest to proces jednoetapowy, związany z kolapsem do struktury natywnej, korzystnej energetycznie, czy proces przebiega wieloetapowo — np. najpierw tworzą się struktury drugorzędowe, które następnie zwijają się tworząc bardziej skomplikowane układy.

==Cel ćwiczenia==

W ćwiczeniu wykorzystamy metodę spektrometrii emisyjnej do badania procesu zwijania i rozwijania wybranego białka. Wykorzystamy zjawisko zmian emisji w zakresie UV białka oraz znacznika fluorescencyjnego, związanych ze zmiana struktury.

'''Celem ćwiczenia jest:'''
Przeprowadzenie w funkcji zmieniającego się stężenia denaturanta — chlorowodorku guanidyny pomiarów fluorescencji samego białka (obserwacja przesuwania się maksimum emisji białka i zmian intensywności emisji w wybranej długości fali) oraz znacznika fluorescencyjnego (BisANS), będącego wskaźnikiem obecności struktur pośrednich procesu zwijania.

Obserwować będziemy:
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zwiększania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze nie zawierającym denaturanta) — rozwijanie białka.
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zmniejszania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze denaturanta o maksymalnym stężeniu) — zwijanie białka.
#Zmianę emisji znacznika fluorescencyjnego, dla którego intensywność emisji zależy od stanu białka i przybiera wartość maksymalną dla stanu tzw. stopionej globuli (ang. ''molten globule''). Pomiary te przeprowadzimy zarówno w funkcji zwijania jak i rozwijania białka.
#Na podstawie przeprowadzonych pomiarów:<ol type="a"><li>określimy właściwości emisyjne białka w stanie rozwiniętym i zwiniętym,<li> scharakteryzujemy procesy zwijania i rozwijania białka,<li> stwierdzimy czy proces zwijania jest procesem odwracalnym,<li>dokonamy krytycznej dyskusji wyników.</ol>

==Materiały stosowane w pracy i metody==

Białko można denaturować poprzez podwyższenie temperatury lub używając detergentów. Są to jednak procesy trudno odwracalne. Powszechnie wykorzystuje się chaotropy, czyli związki chemiczne, które przez zmianę otoczenia łańcucha polipeptydowego wpływają na stopień rozwinięcia białka. Przedstawicielem tej grupy jest '''chlorowodorek guanidyny'' (CH5N3∙HCl), który w dużym stężeniu niszczy strukturę przestrzenna biomolekuł. Zmniejszenie stężenia GdnHCl powoduje powrót do struktury aktywnej biologicznie.

'''4.4’dianilino 1, 1’-binaftaleno 5.5’-kwas disulfonowy''' (BisANS) jest substancją przyłączającą się do hydrofobowych miejsc w strukturze białka. Po przyłączeniu BisANS wykazuje zdolność fluorescencji przy wzbudzeniu 420 nm z maksimum emisji w 490 nm. Znacznik ten stosuje się do monitorowania powstawania intermediatów (stanów pośrednich), dla których powierzchnia hydrofobowa jest bardziej dostępna niż w przypadku natywnej cząsteczki białka (jest to tak zwana struktura stopionej globuli, dla której główny łańcuch białkowy ma właściwa konformację, natomiast łańcuchy boczne nie są jeszcze dobrze ustrukturyzowane).

'''Lizozym''' to niewielkie białko złożone z 129 aminokwasów, o masie 14,4 kDa. Jest to enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii.

W modelu jednoetapowym przejścia ze struktury natywnej do zdenaturowanej
:<math>N\Rightarrow D</math>
można wyznaczyć ilość frakcji natywnej w funkcji stężenia denaturanta. Wykorzystuje się w tym celu zależność fluorescencji w wybranej długości fali od stężenia czynnika denaturującego, przy założeniu, że całkowita fluorescencja jest sumą fluorescencji składników:
:<math>y=y_Nf_N+y_Df_D</math>
gdzie <math>y</math> — całkowita intensywność fluorescencji, <math>y_N</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji natywnej, <math>y_D</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji zdenaturowanej, <math>f_N</math> — ułamek frakcji natywnej, <math>f_D</math> — ułamek frakcji zdenaturowanej.

Po przekształceniach otrzymujemy:
:<math>f_D = \frac{y-y_N}{y_D-y_N}\,</math>

:<math>f_N = \frac{y_D-y}{y_D-y_N}</math>
Stąd możemy wyznaczyć procentowy udział frakcji natywnej i zdenaturowanej w funkcji stężenia denaturanta., a następnie energię swobodną <math>\Delta G</math>

:<math>K = e^{-\frac{\Delta G}{RT}} = \frac{f_D}{f_N}</math>
:<math> \Delta G = -RT\mathrm{ln} K = -RT \mathrm{ln}\frac{f_D}{f_N} </math>,
gdzie <math>R</math> — stała gazowa <math>\unit{8,31 }{\frac{J}{mol\,K}}</math>, <math>T</math> — temperatura [K].

==Warunki przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia==

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego należy do prowadzącego ćwiczenie. Materiał z zakresu spektroskopii emisyjnej obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania części eksperymentalnej ćwiczenia został przedstawiony w niniejszej instrukcji, podczas wykładów „Spektroskopia Molekularna”, „Biologia Molekularna” oraz w umieszczonej na końcu instrukcji bibliografii.

Na kolokwium wstępnym mogą pojawić się następujące zagadnienia:
#Spektroskopia emisyjna. Schemat Jabłońskiego. Co to jest efekt filtra wewnętrznego?
#Budowa spektrofluorymetru i technika pomiarów fluorescencyjnych (widma wzbudzenia i emisji) w zakresie UW.
#Właściwości fluorescencyjne białek. Jakie aminokwasy i dlaczego decydują o fluorescencji białek? Zakres fal wzbudzenia i obserwacji. Zależność intensywności emisji od charakteru otoczenia (polarne, niepolarne).
#Zwijanie białek. Modele procesu, co się dzieje jeśli białka nie zwijają się prawidłowo.
#Rola odczynników stosowanych w badaniach stacjonarnych zwijania (GdnHCl, mocznik, BisANS).

==Wykonanie eksperymentu==

W pomiarach stężenie lizozymu wynosić będzie około 7 μg/μl.

Do dyspozycji mamy:
# 10 mM bufor fosforanowy pH 7.0 (bufor A),
#10 mM bufor fosforanowy zawierający GdnHCl o stężeniu 6 M pH 7.0 (bufor B),
#roztwór Bis ANS o stężeniu 2 mM,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze A,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze B.

Etapy wykonania eksperymentu:

===Dzień 1 i 2===

<ol><li>Przygotowanie roztworów wyjściowych o zmiennym stężeniu GdnHCl w zakresie 0 - 4M i objętości 10 ml zgodnie z tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A
![ml] Objętość bufora B [ml]
|-
|0
|10
|0
|-
|0.2
|9.67
|0.33
|-
|0.4
|9.34
|0.66
|-
|0.6
|9.01
|0.99
|-
|0.8
|8.67
|1.33
|-
|1
|8.34
|1.66
|-
|1.5
|7.50
|2.50
|-
|2
|6.67
|3.33
|-
|2.5
|5.84
|4.16
|-
|3
|5
|5
|-
|4
|3.34
|6.66
|}
<li>Pobieramy po 1.3 ml buforu o wzrastającym stężeniu GdnHCl i wykonujemy pomiar widm w zakresie 300 – 450 nm przy wzbudzeniu w 280 nm i szerokości szczeliny 2.5 nm.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze A o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo zwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze B o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo rozwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.</ol>

===Dzień 3 ===

<ol start=7><li>Opracowanie wyników pomiarów:
<ol type="a"><li>Wykonanie wykresów dla zwiększającego się stężenia GdnHCl w wybranej długości fali dla procesu zwijania i rozwijania białka.
<li> Sprawdzenie jak przesuwa się maksimum emisji w funkcji stężenia GdnHCl dla procesu zwijania i rozwijania białka
(proszę pamiętać o odjęciu w przypadku a. i b. widma tła!).
</ol></ol>

===Dzień 4 i 5===

<ol star=8><li>Przygotowanie roztworów zgodnie z poniższą tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A [ml]
!Objętość bufora B [ml]
!Objętość 2 mM roztworu BisANS [ml]
|-
|0
|9
|0
|1
|-
|0.2
|8.67
|0.33
|1
|-
|0.4
|8.34
|0.66
|1
|-
|0.6
|8.01
|0.99
|1
|-
|0.8
|7.67
|1.33
|1
|-
|1
|7.34
|1.66
|1
|-
|1.5
|6.50
|2.50
|1
|-
|2
|5.67
|3.33
|1
|-
|2.5
|4.84
|4.16
|1
|-
|3
|4
|5
|1
|-
|4
|2.34
|6.66
|1
|}</ol>
#Pobieramy po 1.3 ml każdego z przygotowanych roztworów buforu.
#Przygotowanie próbek białka analogicznie jak w przypadku poprzednich pomiarów.
#Pomiar fluorescencji BisANS w roztworach białka o różnym stężeniu GdnHCl (długość fali wzbudzenia 394 nm, a obserwacji 478 nm, przy szerokości szczeliny 5.0 nm).

===Dzień 5 i 6 — Opracowanie wyników pomiarów.===

<ol start=4><li> Wykonanie wykresów emisji BisANS dla zwiększającego się stężenia GdnHCl, w wybranej długości fali, dla obserwacji zwijania i rozwijania białka (wykonując wykres proszę uwzględnić poprawkę związaną z rozcieńczeniem roztworu GdnHCl poprzez dodanie BisANS).
<li> Wyznaczenie zawartości frakcji natywnej w eksperymentach zwijania i rozwijania białka.
<li> Wyznaczenie energii swobodnej <math>\Delta G</math>.
<li> Wyznaczenie zakresu, w którym białko ma formę stopionej globuli.
<li> Sprawdzenie czy proces zwijania jest odwracalny, czy pojawia się histereza.
<li> Interpretacja uzyskanych wyników.
</ol>

==Literatura:==
#J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
#Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
#A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia [[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki,
#Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
#C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.

Plik:Ilustracja kolejnych kroków metody pochodnej czasowej Stafforda.png

2015-05-22T14:05:54Z

Annach:

Plik:Elipsoidy obrotowe.png

2015-05-22T14:05:48Z

Annach:

Plik:Schemat siły ultrawirowanie v2.png

2015-05-22T14:05:26Z

Annach:

Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych/Ćw 4/I

2015-05-22T14:02:56Z

Annach: /* Wstęp */

'''Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej'''

dr Beata Wielgus-Kutrowska
==Wstęp==

W każdej komórce znajdują się tysiące różnorodnych białek o wyspecjalizowanych funkcjach współpracujących ze sobą. Należą do nich enzymy, białka strukturalne, transportujące, motoryczne, zapasowe, sygnałowe, receptorowe, białka regulujące geny i wiele innych, specyficznych dla konkretnego organizmu i warunków w jakich żyje (np. zapobiegające zamarzaniu ryb). Pomimo tak różnorodnych funkcji, wszystkie białka zbudowane są z takich samych aminokwasów (jest ich około 20). To czym się różnią to kolejności aminokwasów w łańcuchu białkowym, jego długość i struktura przestrzenna makrocząsteczki aktywnej biologicznie. Struktura trójwymiarowa biomolekuły ma fundamentalne znaczenie. Dopiero po jej przyjęciu białko może prawidłowo pełnić swoją funkcję. Natomiast jeśli po utworzeniu, w procesie ekspresji, odpowiedniego łańcucha białkowego, nie dojdzie do jego właściwego skręcenia staje się ono bezużyteczne, a czasem toksyczne dla organizmu. Dobrym przykładem są priony, które występują powszechnie w każdym organizmie i są niegroźne dopóki nie zmienią konformacji, stając się białkiem prionowym infekcyjnym. Priony toksyczne i niegroźne mają identyczną strukturę pierwszorzędową, ale różnią się strukturą drugorzędową (białko PrPC nie wywołujące choroby posiada trzy α-helisy i dwie tzw. β-nici, a patogenne białko PrPSc zawiera przewagę struktury harmonijki β), co wiąże się z odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi — PrPC jest rozpuszczalne w wodzie, natomiast PrPSc jest nierozpuszczalne.

Tak więc aby białka pełniły prawidłowo swoją rolę muszą przybrać właściwą konformację przestrzenną. Pomimo ogromnej różnorodności konformacji białek, można znaleźć pewne cechy wspólne. Jest to tak zwana struktura drugorzędowa, wśród której najczęściej występującymi elementami są β-kartki, α-helisy i fragmenty nieustrukturyzowane (z dokładnym omówieniem tych struktur spotkali się Państwo na wcześniejszych wykładach).

Prawidłowy przebieg procesu przyjmowania właściwej konformacji przestrzennej (proces zwijania, fałdowania, ang. ''folding'') decyduje o tym, czy białko będzie pełnić swoje funkcje. Nic więc dziwnego, że zwijanie białek jest jednym z kluczowych procesów badanych obecnie przez różnorodne zespoły naukowe, wykorzystujące zaawansowane techniki biofizyczne, takie jak spektroskopia (absorpcyjna, emisyjna, dichroizmu kołowego), różnicowa kalorymetria skanująca, spektrometria masowa i inne.

Trzy spośród 20 aminokwasów budujących białka posiadają właściwości emisyjne. Są to tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna. Jednak tylko tryptofan reaguje zmianą intensywności emisji i przesunięcia jej maksimum na zmianę otoczenia, występującą w trakcie zwijania białka, a związaną z przesuwaniem się tryptofanu ze środowiska wodnego, hydrofilowego, do hydrofobowego we wnętrzu cząsteczki (patrz również opis ćwiczenia [[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki). Wykonawszy pomiary zmiany intensywności emisji białka, możemy uzyskać informacje na temat etapów zwijania i ustalić, czy jest to proces jednoetapowy, związany z kolapsem do struktury natywnej, korzystnej energetycznie, czy proces przebiega wieloetapowo — np. najpierw tworzą się struktury drugorzędowe, które następnie zwijają się tworząc bardziej skomplikowane układy.

==Cel ćwiczenia==

W ćwiczeniu wykorzystamy metodę spektrometrii emisyjnej do badania procesu zwijania i rozwijania wybranego białka. Wykorzystamy zjawisko zmian emisji w zakresie UV białka oraz znacznika fluorescencyjnego, związanych ze zmiana struktury.

'''Celem ćwiczenia jest:'''
Przeprowadzenie w funkcji zmieniającego się stężenia denaturanta — chlorowodorku guanidyny pomiarów fluorescencji samego białka (obserwacja przesuwania się maksimum emisji białka i zmian intensywności emisji w wybranej długości fali) oraz znacznika fluorescencyjnego (BisANS), będącego wskaźnikiem obecności struktur pośrednich procesu zwijania.

Obserwować będziemy:
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zwiększania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze nie zawierającym denaturanta) — rozwijanie białka.
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zmniejszania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze denaturanta o maksymalnym stężeniu) — zwijanie białka.
#Zmianę emisji znacznika fluorescencyjnego, dla którego intensywność emisji zależy od stanu białka i przybiera wartość maksymalną dla stanu tzw. stopionej globuli (ang. ''molten globule''). Pomiary te przeprowadzimy zarówno w funkcji zwijania jak i rozwijania białka.
#Na podstawie przeprowadzonych pomiarów:<ol type="a"><li>określimy właściwości emisyjne białka w stanie rozwiniętym i zwiniętym,<li> scharakteryzujemy procesy zwijania i rozwijania białka,<li> stwierdzimy czy proces zwijania jest procesem odwracalnym,<li>dokonamy krytycznej dyskusji wyników.</ol>

==Materiały stosowane w pracy i metody==

Białko można denaturować poprzez podwyższenie temperatury lub używając detergentów. Są to jednak procesy trudno odwracalne. Powszechnie wykorzystuje się chaotropy, czyli związki chemiczne, które przez zmianę otoczenia łańcucha polipeptydowego wpływają na stopień rozwinięcia białka. Przedstawicielem tej grupy jest '''chlorowodorek guanidyny'' (CH5N3∙HCl), który w dużym stężeniu niszczy strukturę przestrzenna biomolekuł. Zmniejszenie stężenia GdnHCl powoduje powrót do struktury aktywnej biologicznie.

'''4.4’dianilino 1, 1’-binaftaleno 5.5’-kwas disulfonowy''' (BisANS) jest substancją przyłączającą się do hydrofobowych miejsc w strukturze białka. Po przyłączeniu BisANS wykazuje zdolność fluorescencji przy wzbudzeniu 420 nm z maksimum emisji w 490 nm. Znacznik ten stosuje się do monitorowania powstawania intermediatów (stanów pośrednich), dla których powierzchnia hydrofobowa jest bardziej dostępna niż w przypadku natywnej cząsteczki białka (jest to tak zwana struktura stopionej globuli, dla której główny łańcuch białkowy ma właściwa konformację, natomiast łańcuchy boczne nie są jeszcze dobrze ustrukturyzowane).

'''Lizozym''' to niewielkie białko złożone z 129 aminokwasów, o masie 14,4 kDa. Jest to enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii.

W modelu jednoetapowym przejścia ze struktury natywnej do zdenaturowanej
:<math>N\Rightarrow D</math>
można wyznaczyć ilość frakcji natywnej w funkcji stężenia denaturanta. Wykorzystuje się w tym celu zależność fluorescencji w wybranej długości fali od stężenia czynnika denaturującego, przy założeniu, że całkowita fluorescencja jest sumą fluorescencji składników:
:<math>y=y_Nf_N+y_Df_D</math>
gdzie <math>y</math> — całkowita intensywność fluorescencji, <math>y_N</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji natywnej, <math>y_D</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji zdenaturowanej, <math>f_N</math> — ułamek frakcji natywnej, <math>f_D</math> — ułamek frakcji zdenaturowanej.

Po przekształceniach otrzymujemy:
:<math>f_D = \frac{y-y_N}{y_D-y_N}\,</math>

:<math>f_N = \frac{y_D-y}{y_D-y_N}</math>
Stąd możemy wyznaczyć procentowy udział frakcji natywnej i zdenaturowanej w funkcji stężenia denaturanta., a następnie energię swobodną <math>\Delta G</math>

:<math>K = e^{-\frac{\Delta G}{RT}} = \frac{f_D}{f_N}</math>
:<math> \Delta G = -RT\mathrm{ln} K = -RT \mathrm{ln}\frac{f_D}{f_N} </math>,
gdzie <math>R</math> — stała gazowa <math>\unit{8,31 }{\frac{J}{mol\,K}}</math>, <math>T</math> — temperatura [K].

==Warunki przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia==

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego należy do prowadzącego ćwiczenie. Materiał z zakresu spektroskopii emisyjnej obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania części eksperymentalnej ćwiczenia został przedstawiony w niniejszej instrukcji, podczas wykładów „Spektroskopia Molekularna”, „Biologia Molekularna” oraz w umieszczonej na końcu instrukcji bibliografii.

Na kolokwium wstępnym mogą pojawić się następujące zagadnienia:
#Spektroskopia emisyjna. Schemat Jabłońskiego. Co to jest efekt filtra wewnętrznego?
#Budowa spektrofluorymetru i technika pomiarów fluorescencyjnych (widma wzbudzenia i emisji) w zakresie UW.
#Właściwości fluorescencyjne białek. Jakie aminokwasy i dlaczego decydują o fluorescencji białek? Zakres fal wzbudzenia i obserwacji. Zależność intensywności emisji od charakteru otoczenia (polarne, niepolarne).
#Zwijanie białek. Modele procesu, co się dzieje jeśli białka nie zwijają się prawidłowo.
#Rola odczynników stosowanych w badaniach stacjonarnych zwijania (GdnHCl, mocznik, BisANS).

==Wykonanie eksperymentu==

W pomiarach stężenie lizozymu wynosić będzie około 7 μg/μl.

Do dyspozycji mamy:
# 10 mM bufor fosforanowy pH 7.0 (bufor A),
#10 mM bufor fosforanowy zawierający GdnHCl o stężeniu 6 M pH 7.0 (bufor B),
#roztwór Bis ANS o stężeniu 2 mM,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze A,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze B.

Etapy wykonania eksperymentu:

===Dzień 1 i 2===

<ol><li>Przygotowanie roztworów wyjściowych o zmiennym stężeniu GdnHCl w zakresie 0 - 4M i objętości 10 ml zgodnie z tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A
![ml] Objętość bufora B [ml]
|-
|0
|10
|0
|-
|0.2
|9.67
|0.33
|-
|0.4
|9.34
|0.66
|-
|0.6
|9.01
|0.99
|-
|0.8
|8.67
|1.33
|-
|1
|8.34
|1.66
|-
|1.5
|7.50
|2.50
|-
|2
|6.67
|3.33
|-
|2.5
|5.84
|4.16
|-
|3
|5
|5
|-
|4
|3.34
|6.66
|}
<li>Pobieramy po 1.3 ml buforu o wzrastającym stężeniu GdnHCl i wykonujemy pomiar widm w zakresie 300 – 450 nm przy wzbudzeniu w 280 nm i szerokości szczeliny 2.5 nm.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze A o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo zwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze B o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo rozwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.</ol>

===Dzień 3 ===

<ol start=7><li>Opracowanie wyników pomiarów:
<ol type="a"><li>Wykonanie wykresów dla zwiększającego się stężenia GdnHCl w wybranej długości fali dla procesu zwijania i rozwijania białka.
<li> Sprawdzenie jak przesuwa się maksimum emisji w funkcji stężenia GdnHCl dla procesu zwijania i rozwijania białka
(proszę pamiętać o odjęciu w przypadku a. i b. widma tła!).
</ol></ol>

===Dzień 4 i 5===

<ol star=8><li>Przygotowanie roztworów zgodnie z poniższą tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A [ml]
!Objętość bufora B [ml]
!Objętość 2 mM roztworu BisANS [ml]
|-
|0
|9
|0
|1
|-
|0.2
|8.67
|0.33
|1
|-
|0.4
|8.34
|0.66
|1
|-
|0.6
|8.01
|0.99
|1
|-
|0.8
|7.67
|1.33
|1
|-
|1
|7.34
|1.66
|1
|-
|1.5
|6.50
|2.50
|1
|-
|2
|5.67
|3.33
|1
|-
|2.5
|4.84
|4.16
|1
|-
|3
|4
|5
|1
|-
|4
|2.34
|6.66
|1
|}</ol>
#Pobieramy po 1.3 ml każdego z przygotowanych roztworów buforu.
#Przygotowanie próbek białka analogicznie jak w przypadku poprzednich pomiarów.
#Pomiar fluorescencji BisANS w roztworach białka o różnym stężeniu GdnHCl (długość fali wzbudzenia 394 nm, a obserwacji 478 nm, przy szerokości szczeliny 5.0 nm).

===Dzień 5 i 6 — Opracowanie wyników pomiarów.===

<ol start=4><li> Wykonanie wykresów emisji BisANS dla zwiększającego się stężenia GdnHCl, w wybranej długości fali, dla obserwacji zwijania i rozwijania białka (wykonując wykres proszę uwzględnić poprawkę związaną z rozcieńczeniem roztworu GdnHCl poprzez dodanie BisANS).
<li> Wyznaczenie zawartości frakcji natywnej w eksperymentach zwijania i rozwijania białka.
<li> Wyznaczenie energii swobodnej <math>\Delta G</math>.
<li> Wyznaczenie zakresu, w którym białko ma formę stopionej globuli.
<li> Sprawdzenie czy proces zwijania jest odwracalny, czy pojawia się histereza.
<li> Interpretacja uzyskanych wyników.
</ol>

==Literatura:==
#J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
#Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
#A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki,
#Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
#C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.

Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych

2015-05-22T14:02:14Z

Annach: Utworzono nową stronę "#Wyznaczanie współczynników dyfuzji i sedymentacji wybranych białek metodą ultrawirowania analitycznego #Praco..."

#[[Pracownia_Biofizyki_dla_Zaawansowanych/Ćw_3/II|Wyznaczanie współczynników dyfuzji i sedymentacji wybranych białek metodą ultrawirowania analitycznego]]
#[[Pracownia_Biofizyki_dla_Zaawansowanych/Ćw_4/I|Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej
]]

Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych/Ćw 4/I

2015-05-22T13:59:21Z

Annach: Utworzono nową stronę "'''Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej''' dr Beata Wielgus-Kutrowska ==Wstęp== W każ..."

'''Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej'''

dr Beata Wielgus-Kutrowska
==Wstęp==

W każdej komórce znajdują się tysiące różnorodnych białek o wyspecjalizowanych funkcjach współpracujących ze sobą. Należą do nich enzymy, białka strukturalne, transportujące, motoryczne, zapasowe, sygnałowe, receptorowe, białka regulujące geny i wiele innych, specyficznych dla konkretnego organizmu i warunków w jakich żyje (np. zapobiegające zamarzaniu ryb). Pomimo tak różnorodnych funkcji, wszystkie białka zbudowane są z takich samych aminokwasów (jest ich około 20). To czym się różnią to kolejności aminokwasów w łańcuchu białkowym, jego długość i struktura przestrzenna makrocząsteczki aktywnej biologicznie. Struktura trójwymiarowa biomolekuły ma fundamentalne znaczenie. Dopiero po jej przyjęciu białko może prawidłowo pełnić swoją funkcję. Natomiast jeśli po utworzeniu, w procesie ekspresji, odpowiedniego łańcucha białkowego, nie dojdzie do jego właściwego skręcenia staje się ono bezużyteczne, a czasem toksyczne dla organizmu. Dobrym przykładem są priony, które występują powszechnie w każdym organizmie i są niegroźne dopóki nie zmienią konformacji, stając się białkiem prionowym infekcyjnym. Priony toksyczne i niegroźne mają identyczną strukturę pierwszorzędową, ale różnią się strukturą drugorzędową (białko PrPC nie wywołujące choroby posiada trzy α-helisy i dwie tzw. β-nici, a patogenne białko PrPSc zawiera przewagę struktury harmonijki β), co wiąże się z odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi — PrPC jest rozpuszczalne w wodzie, natomiast PrPSc jest nierozpuszczalne.

Tak więc aby białka pełniły prawidłowo swoją rolę muszą przybrać właściwą konformację przestrzenną. Pomimo ogromnej różnorodności konformacji białek, można znaleźć pewne cechy wspólne. Jest to tak zwana struktura drugorzędowa, wśród której najczęściej występującymi elementami są β-kartki, α-helisy i fragmenty nieustrukturyzowane (z dokładnym omówieniem tych struktur spotkali się Państwo na wcześniejszych wykładach).

Prawidłowy przebieg procesu przyjmowania właściwej konformacji przestrzennej (proces zwijania, fałdowania, ang. ''folding'') decyduje o tym, czy białko będzie pełnić swoje funkcje. Nic więc dziwnego, że zwijanie białek jest jednym z kluczowych procesów badanych obecnie przez różnorodne zespoły naukowe, wykorzystujące zaawansowane techniki biofizyczne, takie jak spektroskopia (absorpcyjna, emisyjna, dichroizmu kołowego), różnicowa kalorymetria skanująca, spektrometria masowa i inne.

Trzy spośród 20 aminokwasów budujących białka posiadają właściwości emisyjne. Są to tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna. Jednak tylko tryptofan reaguje zmianą intensywności emisji i przesunięcia jej maksimum na zmianę otoczenia, występującą w trakcie zwijania białka, a związaną z przesuwaniem się tryptofanu ze środowiska wodnego, hydrofilowego, do hydrofobowego we wnętrzu cząsteczki (patrz również opis ćwiczenia [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki). Wykonawszy pomiary zmiany intensywności emisji białka, możemy uzyskać informacje na temat etapów zwijania i ustalić, czy jest to proces jednoetapowy, związany z kolapsem do struktury natywnej, korzystnej energetycznie, czy proces przebiega wieloetapowo — np. najpierw tworzą się struktury drugorzędowe, które następnie zwijają się tworząc bardziej skomplikowane układy.

==Cel ćwiczenia==

W ćwiczeniu wykorzystamy metodę spektrometrii emisyjnej do badania procesu zwijania i rozwijania wybranego białka. Wykorzystamy zjawisko zmian emisji w zakresie UV białka oraz znacznika fluorescencyjnego, związanych ze zmiana struktury.

'''Celem ćwiczenia jest:'''
Przeprowadzenie w funkcji zmieniającego się stężenia denaturanta — chlorowodorku guanidyny pomiarów fluorescencji samego białka (obserwacja przesuwania się maksimum emisji białka i zmian intensywności emisji w wybranej długości fali) oraz znacznika fluorescencyjnego (BisANS), będącego wskaźnikiem obecności struktur pośrednich procesu zwijania.

Obserwować będziemy:
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zwiększania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze nie zawierającym denaturanta) — rozwijanie białka.
#Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zmniejszania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze denaturanta o maksymalnym stężeniu) — zwijanie białka.
#Zmianę emisji znacznika fluorescencyjnego, dla którego intensywność emisji zależy od stanu białka i przybiera wartość maksymalną dla stanu tzw. stopionej globuli (ang. ''molten globule''). Pomiary te przeprowadzimy zarówno w funkcji zwijania jak i rozwijania białka.
#Na podstawie przeprowadzonych pomiarów:<ol type="a"><li>określimy właściwości emisyjne białka w stanie rozwiniętym i zwiniętym,<li> scharakteryzujemy procesy zwijania i rozwijania białka,<li> stwierdzimy czy proces zwijania jest procesem odwracalnym,<li>dokonamy krytycznej dyskusji wyników.</ol>

==Materiały stosowane w pracy i metody==

Białko można denaturować poprzez podwyższenie temperatury lub używając detergentów. Są to jednak procesy trudno odwracalne. Powszechnie wykorzystuje się chaotropy, czyli związki chemiczne, które przez zmianę otoczenia łańcucha polipeptydowego wpływają na stopień rozwinięcia białka. Przedstawicielem tej grupy jest '''chlorowodorek guanidyny'' (CH5N3∙HCl), który w dużym stężeniu niszczy strukturę przestrzenna biomolekuł. Zmniejszenie stężenia GdnHCl powoduje powrót do struktury aktywnej biologicznie.

'''4.4’dianilino 1, 1’-binaftaleno 5.5’-kwas disulfonowy''' (BisANS) jest substancją przyłączającą się do hydrofobowych miejsc w strukturze białka. Po przyłączeniu BisANS wykazuje zdolność fluorescencji przy wzbudzeniu 420 nm z maksimum emisji w 490 nm. Znacznik ten stosuje się do monitorowania powstawania intermediatów (stanów pośrednich), dla których powierzchnia hydrofobowa jest bardziej dostępna niż w przypadku natywnej cząsteczki białka (jest to tak zwana struktura stopionej globuli, dla której główny łańcuch białkowy ma właściwa konformację, natomiast łańcuchy boczne nie są jeszcze dobrze ustrukturyzowane).

'''Lizozym''' to niewielkie białko złożone z 129 aminokwasów, o masie 14,4 kDa. Jest to enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii.

W modelu jednoetapowym przejścia ze struktury natywnej do zdenaturowanej
:<math>N\Rightarrow D</math>
można wyznaczyć ilość frakcji natywnej w funkcji stężenia denaturanta. Wykorzystuje się w tym celu zależność fluorescencji w wybranej długości fali od stężenia czynnika denaturującego, przy założeniu, że całkowita fluorescencja jest sumą fluorescencji składników:
:<math>y=y_Nf_N+y_Df_D</math>
gdzie <math>y</math> — całkowita intensywność fluorescencji, <math>y_N</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji natywnej, <math>y_D</math> — jednostkowa fluorescencja frakcji zdenaturowanej, <math>f_N</math> — ułamek frakcji natywnej, <math>f_D</math> — ułamek frakcji zdenaturowanej.

Po przekształceniach otrzymujemy:
:<math>f_D = \frac{y-y_N}{y_D-y_N}\,</math>

:<math>f_N = \frac{y_D-y}{y_D-y_N}</math>
Stąd możemy wyznaczyć procentowy udział frakcji natywnej i zdenaturowanej w funkcji stężenia denaturanta., a następnie energię swobodną <math>\Delta G</math>

:<math>K = e^{-\frac{\Delta G}{RT}} = \frac{f_D}{f_N}</math>
:<math> \Delta G = -RT\mathrm{ln} K = -RT \mathrm{ln}\frac{f_D}{f_N} </math>,
gdzie <math>R</math> — stała gazowa <math>\unit{8,31 }{\frac{J}{mol\,K}}</math>, <math>T</math> — temperatura [K].

==Warunki przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia==

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego należy do prowadzącego ćwiczenie. Materiał z zakresu spektroskopii emisyjnej obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania części eksperymentalnej ćwiczenia został przedstawiony w niniejszej instrukcji, podczas wykładów „Spektroskopia Molekularna”, „Biologia Molekularna” oraz w umieszczonej na końcu instrukcji bibliografii.

Na kolokwium wstępnym mogą pojawić się następujące zagadnienia:
#Spektroskopia emisyjna. Schemat Jabłońskiego. Co to jest efekt filtra wewnętrznego?
#Budowa spektrofluorymetru i technika pomiarów fluorescencyjnych (widma wzbudzenia i emisji) w zakresie UW.
#Właściwości fluorescencyjne białek. Jakie aminokwasy i dlaczego decydują o fluorescencji białek? Zakres fal wzbudzenia i obserwacji. Zależność intensywności emisji od charakteru otoczenia (polarne, niepolarne).
#Zwijanie białek. Modele procesu, co się dzieje jeśli białka nie zwijają się prawidłowo.
#Rola odczynników stosowanych w badaniach stacjonarnych zwijania (GdnHCl, mocznik, BisANS).

==Wykonanie eksperymentu==

W pomiarach stężenie lizozymu wynosić będzie około 7 μg/μl.

Do dyspozycji mamy:
# 10 mM bufor fosforanowy pH 7.0 (bufor A),
#10 mM bufor fosforanowy zawierający GdnHCl o stężeniu 6 M pH 7.0 (bufor B),
#roztwór Bis ANS o stężeniu 2 mM,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze A,
#roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze B.

Etapy wykonania eksperymentu:

===Dzień 1 i 2===

<ol><li>Przygotowanie roztworów wyjściowych o zmiennym stężeniu GdnHCl w zakresie 0 - 4M i objętości 10 ml zgodnie z tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A
![ml] Objętość bufora B [ml]
|-
|0
|10
|0
|-
|0.2
|9.67
|0.33
|-
|0.4
|9.34
|0.66
|-
|0.6
|9.01
|0.99
|-
|0.8
|8.67
|1.33
|-
|1
|8.34
|1.66
|-
|1.5
|7.50
|2.50
|-
|2
|6.67
|3.33
|-
|2.5
|5.84
|4.16
|-
|3
|5
|5
|-
|4
|3.34
|6.66
|}
<li>Pobieramy po 1.3 ml buforu o wzrastającym stężeniu GdnHCl i wykonujemy pomiar widm w zakresie 300 – 450 nm przy wzbudzeniu w 280 nm i szerokości szczeliny 2.5 nm.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze A o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo zwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.
<li>Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze B o stężeniu 1 mg/ml.
<li>Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo rozwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.</ol>

===Dzień 3 ===

<ol start=7><li>Opracowanie wyników pomiarów:
<ol type="a"><li>Wykonanie wykresów dla zwiększającego się stężenia GdnHCl w wybranej długości fali dla procesu zwijania i rozwijania białka.
<li> Sprawdzenie jak przesuwa się maksimum emisji w funkcji stężenia GdnHCl dla procesu zwijania i rozwijania białka
(proszę pamiętać o odjęciu w przypadku a. i b. widma tła!).
</ol></ol>

===Dzień 4 i 5===

<ol star=8><li>Przygotowanie roztworów zgodnie z poniższą tabelą:
{|class="wikitable"
!Stężenie GdnHCl [M]
!Objętość bufora A [ml]
!Objętość bufora B [ml]
!Objętość 2 mM roztworu BisANS [ml]
|-
|0
|9
|0
|1
|-
|0.2
|8.67
|0.33
|1
|-
|0.4
|8.34
|0.66
|1
|-
|0.6
|8.01
|0.99
|1
|-
|0.8
|7.67
|1.33
|1
|-
|1
|7.34
|1.66
|1
|-
|1.5
|6.50
|2.50
|1
|-
|2
|5.67
|3.33
|1
|-
|2.5
|4.84
|4.16
|1
|-
|3
|4
|5
|1
|-
|4
|2.34
|6.66
|1
|}</ol>
#Pobieramy po 1.3 ml każdego z przygotowanych roztworów buforu.
#Przygotowanie próbek białka analogicznie jak w przypadku poprzednich pomiarów.
#Pomiar fluorescencji BisANS w roztworach białka o różnym stężeniu GdnHCl (długość fali wzbudzenia 394 nm, a obserwacji 478 nm, przy szerokości szczeliny 5.0 nm).

===Dzień 5 i 6 — Opracowanie wyników pomiarów.===

<ol start=4><li> Wykonanie wykresów emisji BisANS dla zwiększającego się stężenia GdnHCl, w wybranej długości fali, dla obserwacji zwijania i rozwijania białka (wykonując wykres proszę uwzględnić poprawkę związaną z rozcieńczeniem roztworu GdnHCl poprzez dodanie BisANS).
<li> Wyznaczenie zawartości frakcji natywnej w eksperymentach zwijania i rozwijania białka.
<li> Wyznaczenie energii swobodnej <math>\Delta G</math>.
<li> Wyznaczenie zakresu, w którym białko ma formę stopionej globuli.
<li> Sprawdzenie czy proces zwijania jest odwracalny, czy pojawia się histereza.
<li> Interpretacja uzyskanych wyników.
</ol>

==Literatura:==
#J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
#Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
#A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki,
#Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
#C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.

Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych/Ćw 3/II

2015-05-22T13:58:55Z

Annach: Utworzono nową stronę "Wyznaczanie współczynników dyfuzji i sedymentacji wybranych białek metodą ultrawirowania analitycznego dr Anna Modrak-Wójcik == Wstęp== Celem ćwiczenia..."

Wyznaczanie współczynników dyfuzji i sedymentacji wybranych białek metodą ultrawirowania analitycznego

dr Anna Modrak-Wójcik
== Wstęp==
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie eksperymentów ultrawirowania analitycznego wybranego białka. Na ich podstawie określisz homogenność próbki, wyznaczysz współczynniki dyfuzji i sedymentacji tego białka, określisz jego masę i kształt oraz zbadasz wpływ warunków denaturujących na te parametry.
Ultrawirowanie analityczne umożliwia charakterystykę makrocząsteczek biologicznych w ich stanach natywnych w roztworze, czyli w warunkach najbardziej zbliżonych do warunków panujących w komórkach, bez istnienia zaburzających oddziaływań, np. z matrycami (chromatografia, elektroforeza), czy powierzchniami (mikroskopia sił atomowych). Dostarcza informacji na temat jednorodności próbki (zanieczyszczenia, oligomery, agregaty), pozwala na określenie masy i kształtu makrocząsteczek. Umożliwia też badania tworzenia się i rozpadu kompleksów oraz wyznaczanie stałych równowagi
dla asocjujących układów.
Ze względu na zautomatyzowanie sposobu zbierania danych i ich obróbki
oraz pojawienie się nowych programów obliczeniowych i szybkich komputerów, metody ultrawirowania, zapoczątkowane na początku ubiegłego stulecia, przeżywają obecnie swój renesans.
===Dyfuzja i sedymentacja===
Przemieszczanie się cząsteczek w roztworze przy braku sił zewnętrznych jest wywołane dyfuzją. Energia cieplna powoduje, że cząsteczki wykonują nieustanne chaotyczne ruchy, nazywane ruchami Browna. Proces dyfuzji opisuje pierwsze prawo Fick’a:
<equation id="1">
<math>J_x = -D\frac{\partial c}{\partial x},</math>
</equation>
gdzie: <math>J_x</math> — strumień masy (liczba cząsteczek przechodząca przez jednostkową powierzchnię w jednostce czasu), <math>D</math> — współczynnik dyfuzji translacyjnej, <math>c</math> — stężenie cząsteczek. Wynika z niego, że strumień masy jest proporcjonalny do gradientu stężenia <math>\left(\frac{\partial c}{\partial x}\right)</math>. Znak minus oznacza, że przepływ odbywa się z obszaru o większym stężeniu do obszaru o mniejszym stężeniu. Dyfuzja zapewnia równomierny rozkład stężenia cząsteczek w dostępnej dla nich objętości.

Skomplikowane obliczenia hydrodynamiczne prowadzą do wyrażenia opisującego współczynnik dyfuzji:
<equation id="2">
<math>D=\frac{RT}{fN_\mathrm{A}}</math>
</equation>
gdzie <math>R</math> — stała gazowa, <math>T</math> — temperatura w Kelwinach, <math>f</math> — współczynnik tarcia translacyjnego, <math>N_\mathrm{A}</math> – liczba Avogadro.

Sedymentacja (osiadanie) to ruch cząsteczek w roztworze pod wpływem zewnętrznej siły. Warunkiem jej zachodzenia są różne wartości gęstości cząsteczek rozpuszczonych
i rozpuszczalnika. Przykładem sedymentacji jest opadanie cząsteczek skrobi w świeżo przygotowanej zawiesinie skrobi w zimnej wodzie pod wpływem pola grawitacyjnego. Pole grawitacyjne jest jednak zbyt słabe, by wywołać sedymentację cząsteczek o masach mniejszych niż 107 Da — ze zjawiskiem sedymentacji konkuruje bowiem dyfuzja. Osiadanie cząsteczek o masach odpowiadających masom makrocząsteczek biologicznych wywołują siły odśrodkowe stosowane w wirówkach. Współczesne ultrawirówki analityczne umożliwiają osiągnięcie przyspieszeń odśrodkowych równych 290 000 g i obserwację sedymentacji cząsteczek o masach rzędu kilku kDa. [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB5#Zasada_dzia.C5.82ania_ultrawir.C3.B3wki_analitycznej_XL-I|Szczegółowy opis zasady działania ultrawirówki analitycznej znajdziesz w instrukcji do ćwiczenia PB5 w ramach Pracowni Podstaw Biofizyki]].

===Podstawy fizyczne ultrawirowania===
Na cząsteczkę o masie <math>m</math> znajdującą się w roztworze poddaną wirowaniu z prędkością kątową <math>\omega</math> działają następujące siły: siła odśrodkowa <math>F_\mathrm{o}</math>, siła wyporu <math>F_\mathrm{w}</math> oraz siła tarcia dynamicznego <math>F_\mathrm{t}</math>. Siły te opisane są przez wyrażenia zamieszczone na poniższym schemacie:
[[Plik:schemat_siły_ultrawirowanie_v2.png|center]]
gdzie <math>f</math> to współczynnik tarcia translacyjnego, <math>v</math> — prędkość ruchu cząsteczki, <math>m_\mathrm{w}</math> — masa wypartej przez cząsteczkę cieczy, <math>r</math> — odległość cząsteczki od osi obrotu. Znaki „–” przed siłami tarcia i wyporu wskazują, że siły te działają w przeciwnym kierunku do siły odśrodkowej.

W ciągu bardzo krótkiego czasu (rzędu 10-6 s) siły te równoważą się, a warunek równoważenia się sił prowadzi do tożsamości będącej definicją współczynnika sedymentacji <math>s</math> jako prędkości cząsteczki na jednostkę przyspieszenia odśrodkowego:
<equation id="3">
<math>s\equiv \frac{v}{\omega^2r}=\frac{m(1-\bar{v}\rho)}{f} = \frac{M(1-\bar{v}\rho)}{f N_\mathrm{A}}\;</math>
</equation>
gdzie <math>M</math> — masa molowa cząsteczki, <math>\bar{v}</math> — cząstkowa objętość właściwa cząsteczki (objętość przypadająca na jednostkę masy), <math>\rho</math> — gęstość cieczy (rozpuszczalnika), <math>N_\mathrm{A}</math> — liczba Avogadro <math>(m = \nicefrac{M}{N_\mathrm{A}})</math>.

Współczynnik sedymentacji zależy jedynie od parametrów opisujących badaną molekułę i rozpuszczalnik — od masy molowej i cząstkowej objętości właściwej makrocząsteczki, od współczynnika tarcia (a co za tym idzie od kształtu cząsteczki i lepkości rozpuszczalnika) oraz od gęstości rozpuszczalnika. Współczynnik sedymentacji wyrażamy w Svedbergach,
:1 Svedberg [S] = 10-13 sekundy.
Proces sedymentacji pod wpływem siły odśrodkowej można opisać makroskopowo posługując się pojęciem strumienia masy, wprowadzając do równania Fick’a (<xr id="1"/>) człon zawiązany z osiadaniem:
<equation id="4">
<math>J = s\omega^2rc-D\frac{\partial c}{\partial r}</math>
</equation>
Po uwzględnieniu zasady zachowania masy i sektorowego kształtu naczynka wirówkowego otrzymujemy wyrażenie:
<equation id="5">
<math>\frac{\partial c}{\partial t} = \frac{1}{r}\frac{\partial }{\partial r} \left(rD \frac{\partial c}{\partial r} -s \omega^2r^2c\right)</math>
</equation>
Jest to równanie różniczkowe wyprowadzone w 1929 r. przez Lamma. Opisuje ono ewolucję czasową rozkładu stężenia próbki zawierającej cząsteczki o współczynnikach sedymentacji <math>s</math>
i dyfuzji <math>D</math> podczas wirowania z prędkością kątową <math>\omega</math>. Oprócz szczególnych przypadków, równania Lamma nie można rozwiązać w sposób analityczny.

Korzystając z równania (<xr id="2"/>) opisującego współczynnik dyfuzji <math>D</math> oraz z zależności (<xr id="3"/>) otrzymujemy równanie Svedberga:
<equation id="6">
<math>M=\frac{RTs}{D(1-\bar{v}\rho)}\;</math>
</equation>
Wynika z niego, że pomiary współczynników sedymentacji i dyfuzji umożliwiają wyznaczenie masy molowej makrocząsteczki.

=== Typy eksperymentów ultrawirowania i płynące z nich informacje ===
Istnieją dwa typy doświadczeń wykonywanych za pomocą ultrawirówek analitycznych: eksperyment szybkości sedymentacji (''sedimentation velocity'') i równowagi sedymentacyjnej (''sedimentation eqilibrium''). W pierwszym z nich próbkę, początkowo jednolitą pod względem rozkładu stężenia, poddaje się działaniu znacznych sił odśrodkowych, co powoduje przesuwanie się cząsteczek rozpuszczonych w kierunku dna kuwety i powstanie ostrej granicy miedzy rozpuszczalnikiem i roztworem (Rys. <xr id="fig:1"/>A). Granica ta przemieszcza się z prędkością określoną przez szybkość sedymentacji badanej makrocząsteczki. Rejestracja rozkładu stężenia próbki wzdłuż kuwety w funkcji czasu umożliwia wyznaczenie parametrów hydrodynamicznych: współczynnika sedymentacji, współczynnika dyfuzji (z rozmywania się granicy w czasie), współczynnika tarcia (z równania <xr id="2"/>), a także masy molowej (z równania Svedberga).

[[Plik:Porównanie dwóch typów eksperymentów ultrawirowania.png|thumb|400px|<figure id="fig:1"/>Porównanie dwóch typów eksperymentów ultrawirowania]]
Drugi ze wspomnianych eksperymentów — pomiar równowagi sedymentacyjnej — przeprowadzany jest przy nieco niższych prędkościach obrotowych. Po odpowiednio długim czasie (rzędu kilkunastu-kilkudziesięciu godzin) dochodzi do ustalenia się równowagi między procesem sedymentacji i dyfuzji. Powstaje gradient stężenia cząsteczek rozpuszczonych
(Rys. <xr id="fig:1"/>B), którego rozkład w równowadze nie zależy od czasu. Analiza danych doświadczalnych prowadzi do określenia równowag asocjacyjnych oraz mas cząsteczkowych składników kompleksów.
W ramach niniejszego ćwiczenia przeprowadzisz pierwszy z dwóch typów eksperymentów ultawirowania — eksperyment szybkości sedymentacji.

=== Parametry hydrodynamiczne a kształt cząsteczki ===
Zarówno współczynnik dyfuzji <math>D</math> jak i sedymentacji <math>s</math> zależą od współczynnika tarcia translacyjnego <math>f</math> (równania <xr id="2"/> i <xr id="3"/>), który z kolei pozostaje w ścisłym związku z kształtem poruszającej się cząsteczki. W przypadku gdy cząsteczka jest kulą o promieniu <math>R_\mathrm{S}</math> współczynnik tarcia opisuje wzór Stokesa:
<equation id="7">
<math>f_0 = 6\pi\eta R_\mathrm{s} = 6\pi \eta\left(\frac{3M\bar{v}}{4\pi}\right)^{\frac{1}{3}}</math>
</equation>
Ze względu na to, że siła tarcia zależy od pola powierzchni badanej cząsteczki, a sfera ma najmniejszą powierzchnię spośród wszystkich brył geometrycznych o tej samej objętości, współczynniki tarcia cząsteczek sferycznych są zawsze mniejsze niż niesferycznych.

Kształt większości makrocząsteczek biologicznych odbiega od kształtu idealnej kuli. Można jednak zmodyfikować wzór (<xr id="7"/>) tak by opisywał współczynnik tarcia f cząsteczek o kształcie spłaszczonej lub wydłużonej elipsoidy obrotowej (Rys. <xr id="fig:2"/>).

[[Plik:Elipsoidy obrotowe.png|thumb|center|600px|<figure id="fig:2"/>Elipsoidy obrotowe: (A) spłaszczona (powstająca poprzez obrót elipsy wokół osi małej) i (B) wydłużona (powstająca poprzez obrót elipsy wokół osi wielkiej)]]
Parametrami charakteryzującymi elipsoidę obrotowej są długości dwóch osi symetrii — wielkiej <math>(2a)</math> i małej <math>(2b)</math>. Wartości stosunku <math>\nicefrac{f}{f_0}</math> w zależności od wartości stosunku <math>\nicefrac{a}{b}</math> dla elipsoid wydłużonych i spłaszczonych zostały po raz pierwszy obliczone przez Perrina i są dostępne w formie tabel i za pośrednictwem programów do analizy danych sedymentacyjnych. Na przykład dla wartości stosunku <math>\nicefrac ab = 5\ \nicefrac{f}{f_0} =1,25\ \text{lub} 1,22</math> odpowiednio dla elipsoidy wydłużonej i spłaszczonej. Wartość stosunku <math>\nicefrac{f}{f_0}</math> jest więc miarą stopnia asymetrii badanej makrocząsteczki, stopnia w jakim jej kształt odbiega od kształtu sferycznego (dla sfery <math>\nicefrac ab = 1</math>).

Na podstawie eksperymentu szybkości sedymentacji można uzyskać informacje dotyczące kształtu badanej cząsteczki. Wartość współczynnika tarcia f można wyznaczyć na podstawie zależności (<xr id="3"/>):
<equation id="8">
<math>f = \frac{M(1-\bar{v}\rho)}{sN_\mathrm{A}}</math>
</equation>
Porównując ją z wartością <math>f_0</math> określoną równaniem (<xr id="7"/>) otrzymujemy stosunek <math>\nicefrac{f}{f_0}</math>.

===Metody wyznaczanie współczynników sedymentacji i dyfuzji na podstawie eksperymentu szybkości sedymentacji===
Istnieje kilka metod wyznaczania współczynników sedymentacji i dyfuzji na podstawie eksperymentów szybkości sedymentacji. W ramach Pracowni Podstaw Biofizyki została przedstawiona metoda „punktu środkowego” (midpoint method), w której współczynnik sedymentacji oblicza się poprzez pomiar położenia środka granicy w funkcji czasu. Nie pozwala ona jednak na określenie współczynnika dyfuzji, a co za tym idzie masy i kształtu makrocząsteczki. Pełna analiza wymaga wykorzystania informacji o czasowej ewolucji kształtu granicy. Można to osiągnąć dzięki zastosowaniu zaawansowanych algorytmów, pozwalającym na numeryczne rozwiązanie równania Lamma (<xr id="5"/>). Obecnie dostępnych jest kilka niekomercyjnych programów wykorzystujących różne podejścia
do analizy danych doświadczalnych.

Jedną z często stosowanych procedur jest metoda pochodnej czasowej opracowana
w 1992 r. przez Waltera Stafforda. W oparciu o tę metodę działa program DCDT+ stworzony przez Johna Philo (http://www.jphilo.mailway.com/dcdt+.htm). Program wyznacza pochodne czasowe rozkładów stężenia na podstawie radialnych dystrybucji otrzymanych
w eksperymencie, odejmując parami kolejne rozkłady <math>(\Delta c)</math> i dzieląc przez odpowiadający im odstęp czasowy <math>(\Delta t)</math>. Następnie przeskalowuje je, uniezależniając od czasu. Ostatecznie otrzymujemy rozkład, zwany <math>g(s*)</math>, mówiący o populacji cząsteczek o danym współczynniku sedymentacji. Zakładając gaussowską postać rozkładu <math>g(s*)</math>, z maksimum tego rozkładu można odczytać współczynnik sedymentacji, a z szerokości połówkowej współczynnik dyfuzji (Rys. <xr id="fig:3"/>).

Obecnie coraz większą popularnością cieszy się program SEDFIT stworzony pod koniec ubiegłego stulecia przez Petera Schucka z National Institutes of Health oferujący różne modele do analizy danych (http://www.analyticalultracentrifugation.com). Jednym
z modeli jest ciągły rozkład współczynnika sedymentacji <math>c(s)</math> zdefiniowany jako:
<equation id="9">
<math>a(r,t) = \int c(s)L(s,D(s),r,t)\mathrm ds</math>
</equation>
gdzie <math>a(r, t)</math> to profile radialne stężenia uzyskane podczas eksperymentu ultrawirowania, <math>c(s)</math> odpowiada populacji cząsteczek o współczynniku sedymentacji pomiędzy <math>s</math> a <math>s+\mathrm ds</math>, a <math>L(s, D(s), r, t)</math> to rozwiązanie równania Lamma (<xr id="5"/>) dla cząsteczek o współczynniku sedymentacji <math>s</math> i dyfuzji <math>D</math>.

Zasadniczo, analiza danych przy użyciu równania (<xr id="9"/>) sprowadza się do znalezienia optymalnej kombinacji dużej liczby rozwiązań równania Lamma najlepiej pasującej do danych doświadczalnych. Założeniem modelu przy wyznaczaniu wartości współczynnika dyfuzji <math>D(s)</math> dla cząsteczek o danym współczynniku sedymentacji <math>s</math> jest, że wszystkie rodzaje sedymentujących cząsteczek mają tę samą wartość stosunku <math>\nicefrac{f}{f_0}</math>. Stosunek <math>\nicefrac{f}{f_0}</math> jest parametrem dopasowania. Zastosowanie równania Svedberga (<xr id="6"/>) dla każdej z par <math>s</math> i <math>D(s)</math> prowadzi do transformacji rozkładu <math>c(s)</math> do rozkładu mas molowych <math>c(M)</math>.

[[Plik:Ilustracja kolejnych kroków metody pochodnej czasowej Stafforda.png|thumb|500px|center|<figure id="fig:3"/>Ilustracja kolejnych kroków metody pochodnej czasowej Stafforda, prowadzących do otrzymania współczynników sedymentacji i dyfuzji]]
W ramach niniejszego ćwiczenia analizę danych z eksperymentów szybkości sedymentacji przeprowadzisz za pomocą programu SEDFIT.

===Parametry hydrodynamiczne w warunkach standardowych ===
Tak jak już wcześniej wspomniano, współczynnik sedymentacji zależy od gęstości rozpuszczalnika oraz lepkości roztworu. Wielkości te z kolei zależą od temperatury. Podobnie jest w przypadku współczynnika dyfuzji — na jego wartość również wpływ ma temperatura
i lepkość roztworu. Aby móc porównywać ze sobą wartości współczynników <math>s</math> i <math>D</math> uzyskane w różnych warunkach eksperymentalnych (temperatura, bufor), przelicza się uzyskane wartości dla tzw. warunków standardowych, czyli dla wody w 20 °C zgodnie
z zależnościami:
<equation id="10">
<math>s_{20,\mathrm w} = s\frac{(1-\bar{v}\rho)_{20,\mathrm w}}{(1-\bar{v}\rho)_{T,b}}\cdot \frac{\eta_{T,b}}{\eta_{20,\mathrm w}}</math>
</equation>

<equation id="11">
<math>D_{20,\mathrm w} = D\frac{273,15}{T}\cdot \frac{\eta_{T,b}}{\eta_{20,\mathrm w}}</math>
</equation>
Indeks T,b odnosi się do wartości cząstkowej objętość właściwej makrocząsteczki <math>(\bar{v})</math>, gęstości <math>(\rho)</math> i lepkości <math>(\eta)</math> buforu w temperaturze, w której przeprowadzono dany eksperyment <math>(T)</math>; indeks 20,w oznacza warunki standardowe (woda, 20 °C).

Należy też pamiętać, że współczynnik sedymentacji zależy od stężenia próbki. Homogenne, nie asocjujące cząsteczki wykazują spadek współczynnika sedymentacji wraz ze wzrostem stężenia. Efekt ten jest niewielki dla białek globularnych, staje się znaczący dla cząsteczek o wydłużonym kształcie lub zdenaturowanych. Wywołany jest wzrostem lepkości roztworu przy wyższych stężeniach badanej próbki.

==Wymagania do kolokwium wstępnego==
# Zjawisko absorpcji promieniowania elektromagnetycznego, prawo Lamberta-Beera.
# Podstawy fizyczne ultrawirowania: wyprowadzenie równania Svedberga, definicja współczynnika sedymentacji, równanie Lamma.
# Zasada działania ultrawirówki analitycznej: różnice między wirowaniem analitycznym i preparatywnym, metody detekcji sedymentujących cząsteczek i zakres ich stosowalności, budowa kuwet pomiarowych.
# Typy eksperymentów ultrawirowania.
# Zastosowanie metod ultrawirowania w badaniach makrocząsteczek biologicznych.
# Wpływ warunków denaturujących na strukturę białek.

== Wykonanie ćwiczenia ==
Podczas ćwiczenia przeprowadzisz dwa eksperymenty ultrawirowania typu szybkości sedymentacji dla albuminy z krwi wołu (BSA) przy użyciu ultrawirówki analitycznej XL-I firmy Beckman Coulter. Rozkład stężenia podczas wirowania będziesz monitorować stosując detekcję interferencyjną i absorpcyjną.

Masz do dyspozycji:
* albuminę z krwi wołu w proszku (BSA),
* 20 mM bufor Tris-HCl pH 7,0 zawierający 0,1 M NaCl (bufor A),
* 20 mM buforze Tris-HCl pH 7,0 zawierający 0,1 M NaCl i 6 M chlorowodorek guanidyny (bufor B).

Dzień pierwszy:
# Przygotuj roztwór albuminy o stężeniu 2.5 mg/ml w buforze A (~ 1.5 ml). Roztwór przygotuj z naważki a następnie oznacz jego stężenie spektrofotometrycznie. Współczynnik ekstynkcji albuminy wynosi <math>\varepsilon^{0,1\%}(280) = 0,667</math> (<math>\varepsilon^{0,1\%}</math> odpowiada absorbancji 0,1% roztworu, czyli 1mg/ml, w kuwecie o drodze optycznej 1 cm).
# Roztwór BSA z pkt. 1 wykorzystaj do przygotowania trzech próbek albuminy w buforze A (potrzebne będzie po ~ 0,5 ml każdej) o absorbancjach w kuwecie o drodze optycznej 1,2 cm równych odpowiednio 0,2, 0,5 i 1,0.
# Następny krok to przygotowanie, napełnienie i załadowanie kuwet z próbkami do rotora. Ten etap eksperymentu zostanie wykonany przez asystenta. Szczegółowy opis budowy i sposobu przygotowania kuwet do eksperymentu ultrawirowania znajdziesz w [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB5#Wykonanie_.C4.87wiczenia_i_opracowanie_danych|instrukcji do ćwiczenia PB5]]. Użyjemy dwusektorowych części centralnych o drodze optycznej 12 mm oraz 4-dziurowego rotora. Po skręceniu, każdą z trzech kuwet (mamy trzy próbki — patrz pkt. 2) napełniamy w sposób następujący: lewy sektor — 400 μl buforu, prawy sektor – 390 μl białka (kuwetę kładziemy nakrętką w naszą stronę). Różne wartości objętości buforu i roztworu białka pozwalają na równoczesną obserwację obu menisków, co z kolei umożliwia wykrycie nieszczelności kuwety. Po umieszczeniu rotora z próbkami w komorze wirówki, montujemy monochromator, zasuwamy pokrywę i uruchamiamy pompę próżniową poprzez wciśnięcie przycisku VACUUM na panelu wirówki.
# Z pomocą asystenta, w programie sterującym ultrawirówką ustaw parametry eksperymentu:
#*temperatura 20 °C,
#*obroty 42 000 rpm,
#*detekcja absorpcyjna w 280 nm,
#*detekcja interferencyjna,
#*rejestracja rozkładów radialnych co 5 minut,
#*całkowita liczba zarejestrowanych rozkładów danego typu (absorpcja lub interferencja) dla każdej z próbek &,dash; 200 i zapisz ustawione parametry jako nową metodę.
# Czekając na ustalenie się próżni i temperatury, wykonaj przy niskich obrotach rotora (3000 rpm) widma absorpcyjne próbek w zakresie 240-320 nm dla wybranego punktu kuwety (np. dla ''r'' = 6,5 cm, r to odległość od osi obrotu; kuweta „rozciąga się” w zakresie 5,8-7,2 cm). Zarejestruj również profile radialne każdej z próbek w 280 nm. Czy rozkład stężenia w białka w kuwetach jest jednorodny? Czy absorbancja w 280 nm jest zgodna z Twoimi wcześniejszymi obliczeniami?
#Po ustaleniu się próżni i temperatury zatrzymaj wirówkę, wyzeruj czas na panelu wirówki, wpisz właściwą liczbę obrotów w programie sterującym (42000 rpm) i ponownie uruchom wirówkę. Gdy rotor osiągnie zadaną prędkość odczekaj 15-30 s i rozpocznij eksperyment.
Ponieważ wirowanie potrwa kilkanaście godzin zatrzymamy wirówkę następnego dnia rano.

Dzień drugi:
Powtórz czynności z dnia pierwszego. Tym razem jednak do przygotowania roztworu BSA użyj buforu B (z chlorowodorkiem guanidyny).

==Opracowanie danych==
Do analizę danych z dwóch powyższych eksperymentów wykorzystaj programu SEDFIT (http://www.analyticalultracentrifugation.com). Zastosuj model <math>c(s)</math>. Potrzebna Ci będzie znajomość wartości cząstkowej objętości właściwej BSA oraz gęstości i lepkości stosowanych buforów. Do wyliczania tych wielkości użyj ogólnie dostępnego programu SEDNTERP (http://jphilo.mailway.com/download.htm). Pozwala on na wyznaczenie lepkości i gęstości roztworów składających się z różnych komponentów i w różnych temperaturach oraz cząstkowej objętości właściwej białek na podstawie ich składu aminokwasowego. Sekwencję BSA (Bovine Serum Albumin) znajdziesz w bazie UniProt (http://www.uniprot.org/).

Opracowanie wyników powinno uwzględniać następujące zagadnienia:
# Wyznaczenie rozkładu współczynnika sedymentacji <math>c(s)</math> dla każdej z próbek.
# Określenie stopnia homogenności próbki (BSA znane jest ze skłonności do tworzenia dimerów i oligomerów wyższych rzędów).
# Określenie współczynników sedymentacji, dyfuzji, mas oraz asymetrii poszczególnych populacji cząsteczek.
# Porównanie otrzymanych wartości mas z masą BSA obliczoną na podstawie sekwencji aminokwasowej (UniProt) oraz interpretację uzyskanych wyników.
# Analizę wpływu stężenia BSA w próbce na wartości współczynnika sedymentacji.
# Analizę wpływu warunków denaturujących na parametry hydrodynamiczne.

==Opis końcowy==
Opis końcowy powinien zawierać poszczególne elementy charakterystyczne
dla raportu z przebiegu eksperymentu (streszczenie, wstęp teoretyczny, opis układu doświadczalnego oraz wyniki i ich dyskusję). Opracowanie wyników powinno uwzględniać zagadnienia wyszczególnione powyżej i zostać udokumentowane za pomocą czytelnych tabel i wykresów.
== Literatura==
# Materiał z zakresu ultrawirowania, przedstawiony w trakcie [[Fizyka:Metody_Biofizyki_Molekularnej/Ultrawirowanie_analityczne|wykładu]] i [[FZ:Ćwiczenia_z_Metod_Biofizyki_Molekularnej|ćwiczeń]] „Metody biofizyki molekularnej”, B. Wielgus-Kutrowska
# [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB5|„Ultrawirowanie analityczne — wyznaczanie współczynnika sedymentacji albuminy z krwi wołu (BSA)”]], A. Modrak-Wójcik — opis do ćwiczenia PB5 w ramach Pracowni Podstaw Biofizyki
# „Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami”, red. Z. Jóźwiak i G. Bartosz, PWN 2007
# „Biofizyka molekularna”, Genowefa Ślósarek, PWN 2011
# „Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review”, J. Lebowitz, M. S. Lewis, P. Schuck, Prot. Science 11, pp. 2067-2079, 2002

Podstawy Biofizyki

2015-05-22T13:58:16Z

Annach:

Plik:Rentgenografia 1.png

2015-05-22T13:56:22Z

Annach:

Plik:Rentgenografia 2.png

2015-05-22T13:56:16Z

Annach:

Plik:Fig zad4 rozdzIII.PNG

2015-05-22T13:56:10Z

Annach:

Plik:Fig zad6 rozdzIII.PNG

2015-05-22T13:56:05Z

Annach:

Plik:Chromatogram.png

2015-05-22T13:55:58Z

Annach:

Plik:Mbmc podstawy 1.png

2015-05-22T13:54:58Z

Annach:

Metody biofizyki molekularnej Ćwiczenia Wersja druk

2015-05-22T13:54:32Z

Annach: Utworzono nową stronę " == Metody biofizyki molekularnej — ćwiczenia == === dr Anna Modrak-Wójcik === :Podstawy_fizyczne_metod_biofizyki_molekularnej|Podstawy fizyczne metod biofizyki mo..."

== Metody biofizyki molekularnej — ćwiczenia ==
=== dr Anna Modrak-Wójcik ===
:[[Podstawy_fizyczne_metod_biofizyki_molekularnej|Podstawy fizyczne metod biofizyki molekularnej]]
:[[Chromatografia_elektroforeza|Chromatografia i elektroforeza]]
:[[Metody_hydrodynamiczne|Metody hydrodynamiczne]]
:[[Spektrometria_mas|Spektrometria mas]]
:[[Rentgenografia|Rentgenografia]]
:[[Kalorymetria|Kalorymetria]]

Kalorymetria

2015-05-22T13:53:13Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1 == Jeden z aminokwasów — glutamina — odgrywa kluczową rolę w metabolizmie azotu. Toksyczny amoniak powstający w przemianach aminokwasów w r..."

==Zadanie 1 ==
Jeden z aminokwasów — glutamina — odgrywa kluczową rolę w metabolizmie azotu. Toksyczny amoniak powstający w przemianach aminokwasów w różnych tkankach reaguje z kwasem glutaminowym, prowadząc do powstania glutaminy. Enzym, katalizujący tę reakcję to syntetaza glutaminowa.
===A===
Oblicz stałą równowagi dla reakcji:
:kwas glutaminowy + NH3 ↔ glutamina + H2O
Entalpie swobodne tworzenia Δ''G''° kwasu glutaminowego, amoniaku oraz glutaminy w warunkach standardowych (''T'' = 298 K, p = 1 atm, pH 7, siła jonowa 0.25 M) wynoszą odpowiednio -372,16 kJ/mol, 82,94 kJ/mol, -120,36 kJ/mol.

===B===
W warunkach fizjologicznych stężenie amoniaku wynosi około 10 mM. Oblicz stosunek stężenia glutaminy do stężenia kwasu glutaminowego w warunkach równowagi. (Stężenie H2O przyjmij się równe 1 — stężenie wody praktycznie nie ulega zmianie podczas reakcji).
===C===
W warunkach fizjologicznych glutamina jest syntetyzowana poprzez sprzężenie hydrolizy ATP z powyższą reakcją:
:kwas glutaminowy + NH3 + ATP ↔ glutamina + ADP + Pi
Oblicz Δ''G''° oraz stałą równowagi dla tej reakcji w warunkach standardowych. Entalpie swobodne tworzenia ATP, ADP i Pi wynoszą odpowiednio -2097,89 kJ/mol, -1230,12 kJ/mol i -1059,49 kJ/mol.

===D===
Załóż, że stężenia amoniaku i fosforanu wynoszą około 10 mM, a [ATP]/[ADP] = 1. Jaka jest wartość stosunku stężeń [kwas glutaminowy]/[glutamina] w warunkach równowagi? Jaka powinna być wartość tego stosunku, aby reakcja zaszła spontanicznie?
Wszystkie obliczenia przeprowadź dla ''T'' = 298 K. Wartość stałej gazowej ''R'' = 8,314 J/mol·K = 1,98 cal/mol·K.

==Zadanie 2==
Z eksperymentu ITC prowadzonego w temperaturze 30°C wyznaczono wartość stałej dysocjacji dla oddziaływania dwóch białek ''K''d = 24,5 μM oraz zmianę entalpii dla reakcji asocjacji <math>\Delta H = \unit{-1,45\cdot10^{-4}}{ \frac{kcal}{mmol}}</math>. Oblicz wartość Δ''G'' oraz czynnika entropowego Δ''S'' dla tego procesu. Wyniki wyraź w joulach i kaloriach. Określ typ sterowania reakcji (sterowana entalpowo, entropowo, entalpowo-entropowo).

==Zadanie 3==
Jak wiele wiązań musi powstać między białkiem a ligandem, aby stała dysocjacji kompleksu ''K''d w temperaturze 298 K wynosiła 1 nM? Przyjmij, że energia wiązania wodorowego wynosi -3 kcal/mol, wiązania jonowego -5 kcal/mol, a wiązania van der Waalsa -0,2 kcal/mol.

==Zadanie 4==
Stała asocjacji kompleksu dwóch białek biorących udział w procesie inicjacji translacji — eIF4E i 4EBP — wynosi <math>K_1 = \unit{67 \times 10^{-6}}{\frac 1 M}</math>. Stała ta maleje do wartości <math>K_2 =\unit{ 9,5 \times 10^{-6}}{\frac 1 M}</math> jeśli z eIF4E, zamiast białka 4EBP pełnej długości, wiąże się krótki fragment 4EBP (17 reszt aminokwasowych). Czy w kompleksie zawierającym 4EBP pełnej długości istnieje więcej kontaktów międzycząsteczkowych stabilizujących kompleks w porównaniu z kompleksem zawierającym peptyd? Odpowiedź uzasadnij. Obie stałe asocjacji wyznaczono w 20 °C.
[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Rentgenografia

2015-05-22T13:52:43Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1== Dla dwuwymiarowej sieci pokazanej poniżej narysuj płaszczyzny sieciowe odpowiadające następującym wskaźnikom Millera: (010), (200), (110), (120), (32..."

==Zadanie 1==
Dla dwuwymiarowej sieci pokazanej poniżej narysuj płaszczyzny sieciowe odpowiadające następującym wskaźnikom Millera: (010), (200), (110), (120), (320).

[[Plik:rentgenografia_1.png]]

==Zadanie 2==
Dla kryształu należącego do układu regularnego uporządkuj w kierunku wzrastającej odległości międzypłaszczyznowej następujące zbiory płaszczyzn: (100), (320), (010), (120), (110).
==Zadanie 3==
Wyprowadź równanie Bragga.
==Zadanie 4 ==
Wiązka promieniowania X o długości fali <math>\lambda = \unit{1,34}{ \AA}</math> pada na kryształ NaCl pod kątem 60° w stosunku do pewnej rodziny płaszczyzn sieciowych odległych o <math>d = \unit{2,70}{ \AA}</math> (patrz rysunek). O jakie kąty należy obracać kryształ wokół osi prostopadłej do płaszczyzny rysunku, aby w wyniku odbić od tych płaszczyzn powstawały maksima promieniowania ugiętego na krysztale?

[[Plik:rentgenografia_2.png]]

==Zadanie 5 ==
Wiązka promieniowania X o długości fali <math>\lambda = \unit{1,537}{\AA}</math> pada na kryształ aluminium. Odbicie pierwszego rzędu od płaszczyzny (111) zaobserwowano pod kątem <math>\theta = 19,2^o</math>. Wyznacz masę atomową aluminium, wiedząc, że kryształ aluminium ma strukturę regularną centrowaną na ścianach, a gęstość aluminium wynosi <math>\rho = \unit{2699}{\frac{kg}{m^3}}</math>. Liczba Avogadro jest równa <math>NA = \unit{6,02 \times 10^{23 }}{\frac 1{mol}}</math>.

==Zadanie 6 ==
Narysuj sieć odwrotną do dwuwymiarowej sieci rzeczywistej o parametrach <math>a = \unit 3 \AA,\ b = \unit 2 \AA,\ \gamma = 30^o</math>.

==Zadanie 7 ==
Jaka jest krótkofalowa granica widma ciągłego lampy rentgenowskiej przy napięciach pracy <math>U_1 =\unit{ 10}{ kV}</math> i <math>U_2 =\unit{ 30}{ kV}</math>?
:<math>e = \unit{1,602 \times 10^{-19}}C,\ h = \unit{6,626 \times 10^{-34}}{ Js},\ c = \unit{3 \times 10^8}{ \frac m s}</math>

==Zadanie 8 ==
Oblicz długość fali charakterystycznego promieniowania rentgenowskiego linii <math>\mathrm{K}_\alpha</math> i <math>\mathrm{K}_\beta</math> dla miedzi (''Z'' = 29) i molibdenu (''Z'' = 42). Skorzystaj z zależności Moseleya:
:<math>\lambda = \frac{1}{R(Z-\sigma)^2\cdot \left( \frac 1{n^2_k}-\frac 1{n^2_p}\right)}</math>
gdzie: R — stała Rydberga, Z — liczba atomowa pierwiastka, σ — stała ekranowania, dla serii K <math>\sigma = 1, nk</math> — główna liczba kwantowa powłoki, na którą następuje przeskok elektronu, <math>n_p</math> — główna liczba kwantowa powłoki, z której następuje przeskok elektronu.
<math>R = \unit{1,097 \times 10^7}{\frac 1 m}</math>, ''Z''Cu = 29, ''Z''Mo = 42
[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Spektrometria mas

2015-05-22T13:52:13Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1 == Do oddzielania jonów uranu o masie <math>m = \unit{3,92\times 10^{-25}}{ kg}</math> i ładunku <math>q = \unit{3,2\times 10^{-19}}{ C}</math> od jonów p..."

==Zadanie 1 ==
Do oddzielania jonów uranu o masie <math>m = \unit{3,92\times 10^{-25}}{ kg}</math> i ładunku <math>q = \unit{3,2\times 10^{-19}}{ C}</math> od jonów podobnego rodzaju stosuje się spektrometr masowy. Jony przyspieszane są przez różnicę potencjałów <math>U = \unit{100}{ kV}</math>, a następnie przez szczelinę wejściową dostają się w obszar jednorodnego pola magnetycznego o indukcji <math>B = \unit{495}{ mT}</math>, gdzie poruszają się po torze kołowym. Po zmianie kierunku o 180° i przejściu przez szczelinę wyjściową jony trafiają do specjalnego zbiornika.
<ol type = "a">
<li>W jakiej odległości od siebie znajdują się szczeliny wejściowa i wyjściowa separatora?
<li>Wiedząc, że natężenie prądu jonów uranu wynosi <math>I = \unit{22,7}{ mA}</math>, oblicz jaką ilość uranu uzyskuje się w ciągu godziny.
<li>Jaka ilość energii termicznej wydziela się w tym czasie w zbiorniku?
</ol>
==Zadanie 2 ==
Wyprowadź zależność wiążącą czas przelotu jonu o danej wartości <math>\nicefrac m z</math>, jeśli droga którą przebywa w analizatorze spektrometru masowego wynosi ''L'', a potencjał przyspieszający jest równy ''U''. Przeprowadź obliczenia dla <math>L =\unit{ 30}{ cm}</math>, <math> \nicefrac m z= 200</math>, <math>U = \unit{3}{ kV}</math>.
: <math> \unit{1}{ u} = \unit{1,66 \times 10^{-27}}{kg},\ \unit{1}{ e} = \unit{1,602 \times 10^{-19}}{ C}</math>

==Zadanie 3==
Czy rozdzielczość ''R'' = 5000 jest wystarczająca by rozdzielić jony C5H9+ od CF3+?
:<math>m_\mathrm{C} = \unit{12}{ u},\ m_\mathrm{H} = \unit{1.007825}{ u},\ m_\mathrm{F} = \unit{18.998403}{ u},\ m_\mathrm{e} = \unit{0.000548}{ u}</math>

==Zadanie 4 ==
W widmie masowym ESI/MS lizozymu widocznych jest kilka pików, odpowiadających jonom dodatnim o różnych ładunkach, wśród nich sąsiadujące ze sobą piki o wartościach <math>\nicefrac m z</math> = 1432 i 1592. Oblicz masę cząsteczkową lizozymu. Załóż, że ładunek jonów wynika z protonacji białka, a wartości z dla wymienionych pików różnią się o jeden.

==Zadanie 5==
Awidyna to białko występującą w jajach płazów i ptaków. Wykazuje bardzo silne powinowactwo do biotyny (jest to jedno z najmocniejszych zaobserwowanych w przyrodzie oddziaływań niekowalencyjnych). Widmo masowe ESI/MS awidyny składa się z wielu pików odpowiadających pojedynczej cząsteczce awidyny o różnych ładunkach. Dwa spośród pików mają <math>\nicefrac m z</math> = 4058 i 4312. Gdy awidyna przed wykonaniem widma jest inkubowana z biotyną piki te mają wartości <math>\nicefrac m z</math> = 4002 i 4251. Określi ile cząsteczek biotyny wiąże się z jedną cząsteczką awidyny. Masa cząsteczkowa biotyny wynosi 244. Załóż, że wartości z dla wymienionych pików różnią się o jeden.

[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Metody hydrodynamiczne

2015-05-22T13:51:44Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1== Oblicz wartość przyspieszenia odśrodkowego (w jednostkach g) działającego na próbkę podczas eksperymentu ultrawirowania. Przyjmij, że rotor obraca..."

==Zadanie 1==
Oblicz wartość przyspieszenia odśrodkowego (w jednostkach g) działającego na próbkę podczas eksperymentu ultrawirowania. Przyjmij, że rotor obraca się z maksymalną prędkością <math>\omega</math> = 60 000 obrotów/min (rpm), a odległość kuwety pomiarowej od osi obrotu wynosi około <math>r = \unit{6,5}{ cm}</math>.

==Zadanie 2==
Wyprowadź zależność wiążącą masę molową ''M'', współczynnik sedymentacji ''s'' i współczynnik dyfuzji ''D'' (równanie Svedberga).

==Zadanie 3==
Współczynnik dyfuzji 2% roztworu globularnego białka o masie cząsteczkowej <math>M = \unit{68}{ kDa}</math> w temperaturze <math>T = \unit{20}{ ^oC}</math> wynosi <math>D = \unit{6,9 \times 10^{-7}} {\frac{cm^2}s}</math>. Cząstkowa objętości właściwa białka wynosi <math>\bar{v} =\unit{0,749}{\frac{cm^3}{g}}</math>, a współczynnik lepkości wody w tej temperaturze jest równy <math>\eta = \unit{1,002}{ mPa\cdot s}</math>. Oblicz promień uwodnionej cząsteczki białka i stopień uwodnienia. Stała gazowa <math>R = \unit{8,31}{ \frac J {Kmol}}</math>, liczba Avogadro <math>N_A = \unit{6,02\times 10^{23}} {\frac 1 {mol}}</math>.

==Zadanie 4 ==
Współczynnik sedymentacji ''s'' wyznacza się często poprzez pomiar położenia środka granicy (<math>r_{\nicefrac{1}{2}}</math>) w funkcji czasu. Roztwór białka o masie cząsteczkowej <math>M = \unit{74}{ kDa}</math> i cząstkowej objętości właściwej <math>\bar{v} = \unit{0,737}{ \frac{cm^3}{g}}</math> poddano wirowaniu w temperaturze <math>\unit{20}{^oC}</math> z prędkością 52000 rpm (obroty na minutę). Gęstość buforu w tej temperaturze wynosi <math>\rho = \unit{1,01}{ \frac{g}{cm^3}}</math>, a współczynnik lepkości <math>\eta = \unit{1,002}{ mPa\cdot s}</math>. Otrzymano następujące wyniki:

{|class="wikitable"
!t [min]
!<math>r_{\nicefrac{1}{2}}</math> [cm]
!<math>\mathrm{ln}\left( r_{\nicefrac{1}{2}}\right)</math>
|-
|0
|5,8591
|1,76800
|-
|30
|5,9541
|1,78408
|-
|60
|6,0763
|1,80440
|-
|90
|6,201
|1,82471
|-
|120
|6,3282
|1,84502
|-
|150
|6,4581
|1,86534
|-
|180
|6,5905
|1,88563
|}

[[Plik:fig_zad4_rozdzIII.PNG|500px]]

Oblicz:
<ol type="a">
<li>współczynnik sedymentacji ''s'',
<li>współczynnik tarcia ''f'',
<li>współczynnik dyfuzji ''D'',
<li>wartość <math>\nicefrac f{f_o}</math>, gdzie <math>f_o</math> jest współczynnikiem tarcia dla cząsteczki sferycznej (nie uwodnionej).
</ol>

==Zadanie 5 ==
Duże cząsteczki DNA kształtem przypominają wydłużoną elipsoidę obrotową. Współczynnik tarcia takiej cząsteczki wynosi w przybliżeniu <math>f = \frac{6π\eta a}{[ln(2a/b)]}</math>, gdzie <math>\eta</math> — współczynnik lepkości rozpuszczalnika, ''a'' i ''b'' — odpowiednio długa i krótka oś elipsoidy. Cząsteczka DNA
o masie cząsteczkowej <math>M = \unit{1000000}{ ma}</math> długość około <math>\unit{5200}{\AA}</math> i średnicę <math>\unit{22} {\AA}</math>. Oblicz współczynnik dyfuzji ''D'' oraz współczynnik sedymentacji ''s'' dla tego DNA w <math>\unit{0,1}{ M}</math> NaCl w temperaturze 20 °C. Gęstość buforu w tej temperaturze wynosi <math>\rho = \unit{1,0025}{\frac{ g}{cm^3}}</math>, jego współczynnik lepkości <math>\eta = \unit{1,016}{ mPa\cdot s}</math>, a cząstkowa objętość właściwa DNA <math>\bar{v}= \unit{0,556}{ \frac{cm^3}{g}}</math>.

==Zadanie 6 ==
Dla pewnego białka przeprowadzono eksperyment wirowania równowagowego w temperaturze 20 °C w dwóch różnych pH: 7,0 i 10,5. Cząstkowa objętości właściwa białka wynosi <math>\bar{v} = \unit{0,749}{ \frac{cm^3}{g}}</math>, a gęstość buforu w tej temperaturze wynosi <math>\rho = \unit{0,9982}{\frac{ g}{cm^3}}</math>. Prędkość wirowania wynosiła 30000 rpm w pH 7,0 i 40000 rpm w pH 10,5. Otrzymano następujące wyniki:
{|class="wikitable"
!<math>\unit{r^2}{ [cm^2]}</math>
!<math>\unit{c}{ [\mu M]}</math>, pH 7,0
!<math>\mathrm{ln}(c)</math>, pH 7,0
!<math>\unit{c}{ [\mu M]}</math>, pH 10,5
!<math>\mathrm{ln}(c)</math>, pH 10,5
|-
|49,0
|0,431
| -0,84165
|0,333
| -1,09961
|-
|49,1
|0,611
| -0,49266
|0,388
| -0,94675
|-
|49,2
|0,865
| -0,14503
|0,453
| -0,79186
|-
|49,3
|1,22
|0,19885
|0,529
| -0,63677
|-
|49,4
|1,72
|0,54232
|0,616
| -0,48451
|-
|49,5
|2,44
|0,892
|0,72
| -0,3285
|-
|49,6
|3,46
|1,24127
|0,84
| -0,17435
|-
|49,7
|4,89
|1,58719
|0,98
| -0,0202
|-
|49,8
|6,91
|1,93297
|1,14
|0,13103
|-
|49,9
|9,78
|2,28034
|1,33
|0,28518
|-
|50,0
|14,2
|2,65324
|1,55
|0,43825
|}

[[Plik:fig_zad6_rozdzIII.PNG|500px]]

<ol type="a">
<li>Oblicz masę cząsteczkową białka w obydwu pH.
Wskazówka: w stanie równowagi sedymentacyjnej zachodzi:
:<math>ln(c) = \frac{M(1-\rho\bar{v})\omega^2r^2}{2RT} + \mathrm{const}</math>
<li>Jak wytłumaczyć zależność masy cząsteczkowej od pH?
</ol>
[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Chromatografia elektroforeza

2015-05-22T13:51:18Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1== Chromatogram 1 uzyskano metodą chromatografii HPLC (highperformance liquid chromatography) dla próbki będącej mieszaniną dwóch cukrów A i B. Chromat..."

==Zadanie 1==
Chromatogram 1 uzyskano metodą chromatografii HPLC (highperformance liquid chromatography) dla próbki będącej mieszaniną dwóch cukrów A i B. Chromatogram 2 uzyskano dla tej samej mieszaniny, ale zastosowano inne warunki HPLC.

[[Plik:chromatogram.png]]

Rozważ następujące zmiany warunków, w których uzyskano chromatogram 2:
<ol type="a">
<li> zmniejszenie ciśnienia fazy mobilnej,
<li> zmniejszenie temperatury,
<li> zastosowanie kolumny o mniejszym stopniu upakowania,
</ol>
Która z powyższych zmian odpowiada za różnice widoczne między chromatogramami 1 i 2? Odpowiedź uzasadnij.

==Zadanie 2==
Karbamoilotransferaza asparaginianowa (ATC-aza) to enzym biorący udział w syntezie zasad azotowych z grupy pirymidyn. Posiada niezwykłą budowę podjednostkową, która można określić stosując filtrację żelową (chromatografia typu sita molekularnego) i elektroforezę denaturującą (SDS-PAGE; SDS polyacrylamide gel electrophoresis). Hipotetyczne wyniki zostały zebrane poniżej.

Tabela <xr id="fig:tab_1"/> zawiera listę białek użytych do kalibracji kolumny chromatograficznej, ich masy cząsteczkowe oraz objętości, przy których zostały wymyte z kolumny.
<ol type="a">
<li>Objętość elucji karbamoilotransferazy asparaginianowej na tej kolumnie wynosi 101 ml. Ile wynosi jej masa cząsteczkowa?
<figure id="fig:tab_1">
{|class="wikitable"
!Białko
!Masa cząsteczkowa M [g]
!Objętość elucji V [ml]
|-
|Cytochrom c
|12 400
|208
|-
|Mioglobina
|17 800
|194
|-
|Chymotrypsynogen
|25 000
|185
|-
|BSA
|66 200
|152
|-
|'''Dehydrogenaza mleczanowa'''
|'''295 000'''
|'''102'''
|-
|'''Apoferrytyna '''
|'''475 000'''
|'''90'''
|}
</figure>
<li> Enzym został poddany działaniu czynnika redukującego mostki disiarczkowe i ponownie przepuszczony przez kolumnę. Tym razem pojawiły się dwa piki, przy objętości 138 i 174 ml. Jakim masom odpowiadają?
<li> Następnie przeprowadzono elektroforezę denaturującą enzymu na żelu poliakrylamidowym. Białka przedstawione w tabeli <xr id="fig:tab_2"/> zostały użyte do kalibracji żelu. Na żelu zaobserwowano dwa prążki pochodzące od karbamoilotransferazy w odległości 58 i 82 mm od początku żelu separującego. Jakie masy im odpowiadają?
<figure id="fig:tab_2">
{|class="wikitable"
!Białko
!Masa cząsteczkowa M [g]
!Odległość d [mm]
|-
|Lizozym
|14 400
|88
|-
|β-laktoglobulina
|18 400
|78,2
|-
|Anhydraza węglanowa
|29 000
|70,0
|-
|Dehydrogenaza mleczanowa
|35 000
|55,2
|-
|'''Ovalbumina'''
|'''45 000 '''
|'''46,0'''
|-
|'''BSA '''
|'''66 200'''
|'''30,2'''
|-
|'''β-galaktozydaza '''
|'''116 000 '''
|'''10,0'''
|}
</figure>
<li> Jakie wnioski dotyczące budowy czwartorzędowej karbamoilotransferazy aspartanowej możesz wysnuć na podstawie wyników uzyskanych w pktach a.-c.?
</ol>
==Zadanie 3==
Punkt izoelektryczny pewnego białka jest równy wartości pH , w którym przeprowadzana jest elektroforeza natywna. Do której elektrody (do katody czy anody) będzie migrowało to białko?
==Zadanie 4==
Jak zwiększenie stężenia akrylamidu wpływa na rozmiary porów żelu i rozdział makrocząsteczek pod względem wielkości?
==Zadanie 5==
Jakiego typu nośnika używa się w przypadku elektroforezy makrocząsteczek o masach większych niż <math>\unit{100\times10^3}{ kDa}</math> (np. dwuniciowego DNA), które są zbyt duże by penetrować pory żelu poliakrylamidowego?
==Zadanie 6==
Który z poniższych czynników: pH, siła jonowa, temperatura czy natężenie prądu, mają największy wpływ na rozdział białek w przypadku elektroforezy natywnej? Odpowiedź uzasadnij.

[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Podstawy fizyczne metod biofizyki molekularnej

2015-05-22T13:50:31Z

Annach: Utworzono nową stronę "==Zadanie 1 == Wiązka elektronów o energii kinetycznej <math>E_k</math> opuszczę rurę akceleratora i wpada w obszar jednorodnego pola magnetycznego. W odległości d..."

==Zadanie 1 ==
Wiązka elektronów o energii kinetycznej <math>E_k</math> opuszczę rurę akceleratora i wpada w obszar jednorodnego pola magnetycznego. W odległości d od miejsca, w którym elektrony wchodzą w obszar pola, prostopadle do kierunku wiązki, umieszczona jest metalowa płyta. Jaka jest minimalna wartości indukcji pola magnetycznego, przy której nie dojdzie do zderzenia wiązki z płytą? Jaki powinien być kierunek wektora indukcji pola magnetycznego?

[[Plik:mbmc_podstawy_1.png|400px]]

==Zadanie 2==
Elektron przyspieszony przez różnicę potencjałów <math>U_1 = \unit{1}{ kV}</math> został następnie skierowany w obszar między dwiema metalowymi płytkami, odległymi o <math>L = \unit{10}{mm}</math>. Między płytkami występuje różnica potencjałów <math>U_2</math> oraz panuje jednorodne pole magnetyczne o wartości indukcji <math>B = \unit{0,5}{ mT}</math>, skierowane prostopadle zarówno do toru elektronu, jak i do kierunku wektora natężenia pola elektrycznego. Jaka powinna być wartość różnicy potencjałów <math>U_2</math> między płytkami, aby elektron poruszał się wzdłuż linii prostej?

Masa elektronu wynosi <math>m = \unit{9,11 \times 10^{-31}}{ kg}</math>, a ładunek elektronu jest równy <math>e = \unit{1,6 \times 10^{-19}}{ C}</math>.

==Zadanie 3==
Proton o energii kinetycznej <math>\unit{1}{ MeV}</math> porusza się po okręgu w jednorodnym polu magnetycznym. Jaka musi być energia:
<ol type="a">
<li> cząstki <math>\alpha\ (q = +2e,\ m = 4u)\;</math>,
<li> deuteronu <math>(q = +e,\ m = 2u)\;</math>, by poruszały się po tym samym okręgu co proton?
</ol>

==Zadanie 4==
Metoda Stokesa pomiaru współczynnika lepkości <math>\eta</math> polega na pomiarze prędkości opadania kulki w ośrodku badanym. Prędkość wyznacza się mierząc czas ''t'', w którym opadająca kulka pokonuje odległość ''h''. Pomiaru dokonuje się, gdy kulka porusza się ruchem jednostajnym. Zakładając, że znana jest gęstość substancji badanej <math>\rho</math>, masa kulki ''m'' i jej promień ''r'', wyprowadź zależność, z której, dzięki przeprowadzonym pomiarom ''t'' i ''h'', można wyznaczyć lepkość.

Wskazówka: zgodnie z prawem Stokesa, siła oporu środowiska działająca na ciało w kształcie kuli wynosi <math>F_\mathrm{op} = 6\pi\eta vr</math>.
==Zadanie 5 ==
Energia wiązania C-C wynosi około 340 kJ/mol, C=C 600 kJ/mol, a C-H 400 kJ/mol. Oblicz energię promieniowania rentgenowskiego o długości fali <math>\lambda = 0.585 \AA</math> oraz <math>\lambda= 1.54 \AA</math>. Co możesz powiedzieć o stabilności biomolekuł naświetlanych promieniami X na podstawie uzyskanych wyników? Pamiętaj, że podana energia wiązań to energia przypadającą na mol.
[[category:Ćwiczenia z Metod Biofizyki Molekularnej]]
[[category:Biofizyka]]

Metody Biofizyki Molekularnej - ćwiczenia

2015-05-22T13:50:09Z

Annach:

#[[Podstawy_fizyczne_metod_biofizyki_molekularnej|Podstawy fizyczne metod biofizyki molekularnej]]
#[[Chromatografia_elektroforeza|Chromatografia i elektroforeza]]
#[[Metody_hydrodynamiczne|Metody hydrodynamiczne]]
#[[Spektrometria_mas|Spektrometria mas]]
#[[Rentgenografia|Rentgenografia]]
#[[Kalorymetria|Kalorymetria]]

(autor dr Anna Modrak-Wójcik)

[[Metody_biofizyki_molekularnej_Ćwiczenia_Wersja_druk|Wersja do druku]]

Podstawy Biofizyki

2015-05-22T13:47:30Z

Annach: Utworzono nową stronę "#Ćwiczenie 2 — Spektroskopia podczerwieni (dr Beata Wielgus-Kutrowska) #*Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB2|Badanie tworzenia wiązań wodorowych w wybranych czą..."

#Ćwiczenie 2 — Spektroskopia podczerwieni (dr Beata Wielgus-Kutrowska)
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB2|Badanie tworzenia wiązań wodorowych w wybranych cząsteczkach chemicznych ]]
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB2a|Identyfikacja i ocena stężenia wybranych związków organicznych na podstawie widm w podczerwieni.]]
#Ćwiczenie 3 — Mikroskopia konfokalna — zastosowanie w badaniach układów biologicznych na przykładzie chloroplastów (dr hab. Borys Kierdaszuk)
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB3|Wyznaczenie struktury chloroplastów w warunkach naturalnych przy 6 mM stężeniu jonów magnezu (Mg2+)]]
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB3a|Wyznaczenie struktury chloroplastów w warunkach w nieobecności jonów magnezu (Mg2+)]]
#Ćwiczenie 4
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4|Badanie kompleksowania jonów wapnia z EDTA metodą izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego]] (dr Beata Wielgus-Kutrowska)
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne]] (dr Anna Modrak-Wójcik)
#[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB5|Ćwiczenie 5 — Ultrawirowanie analityczne — wyznaczanie współczynnika sedymentacji albuminy z krwi wołu (BSA)]] (dr Anna Modrak-Wójcik)
#Ćwiczenie 8 — Spektroskopia 1H NMR — asocjacja między zasadą modyfikowaną a zasadami potencjalnie komplementarnymi na przykładzie N6-metoksyadeniny (dr hab. Borys Kierdaszuk)
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB8|Wyznaczenie selektywnej asocjacji i stałej asocjacji dla kompleksu z cytydyną]]
#*[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB8a|Wyznaczenie selektywnej asocjacji i stałej asocjacji dla kompleksu z urydyną]]
#[[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB10|Ćwiczenie 10 — Czytnik mikropłytek — pomiary absorpcji i fluorescencji tryptofanu]] (dr Anna Modrak-Wójcik)
Autorzy: dr Beata Wielgus-Kutrowska, dr Anna Modrak-Wójcik, dr hab. Borys Kierdaszuk

Plik:Nowoczesny nanokalorymetr ITC200.png

2015-05-22T13:45:23Z

Annach:

Plik:Widma absorbcji i fluorescencji aminokwasów aromatycznych.png

2015-05-22T13:44:38Z

Annach:

Plik:ALB structure.png

2015-05-22T13:44:34Z

Annach:

Plik:Schemat siły ultrawirowanie.png

2015-05-22T13:44:29Z

Annach:

Plik:Układ detekcji absorpcyjnej UVVIS.png

2015-05-22T13:44:23Z

Annach:

Plik:Rotory analityczne.png

2015-05-22T13:44:18Z

Annach:

Plik:Budowa kuwety do wirówki analitycznej.png

2015-05-22T13:44:09Z

Annach:

Plik:Porównanie dwóch typów eksperymentów ultrawirowania.png

2015-05-22T13:44:01Z

Annach:

Plik:Profil absorpcyjny dla eksperymentu szybkości sedymentacji.png

2015-05-22T13:43:49Z

Annach:

Plik:Równowaga tautomeryczna amino-imino.png

2015-05-22T13:43:44Z

Annach:

Plik:Typowe widmo 1H NMR pochodnej OMe6A in C2HCl3.png

2015-05-22T13:43:16Z

Annach:

Plik:Diagram Jabłońskiego przedstawiający uproszczony układ poziomów elektronowo-oscylacyjnych singletowych (S) i tripletowych (T) cząsteczki.png

2015-05-22T13:43:12Z

Annach:

Plik:Płytka 96-dołkowa.png

2015-05-22T13:43:05Z

Annach:

Plik:Schemat absorpcyjnego układu pomiarowego czytnika Infinite 200R PRO.png

2015-05-22T13:43:00Z

Annach:

Plik:Schemat układu pomiarowego emisji fluorescencji czytnika Infinite 200R PRO.png

2015-05-22T13:42:55Z

Annach:

Plik:Fenyloalanina.svg

2015-05-22T13:42:46Z

Annach:

Plik:L-tyrosine-skeletal.png

2015-05-22T13:42:37Z

Annach:

Plik:L-Tryptophan - L-Tryptophan.svg

2015-05-22T13:42:13Z

Annach:

Plik:Guanidinium chloride V.2.svg

2015-05-22T13:42:07Z

Annach:

Plik:Struktura EDTA.png

2015-05-22T13:42:02Z

Annach:

Plik:Różnice między stukturą nienaruszonych (naturalnych) chloroplastów groszku (pea) i fasolki (bean).png

2015-05-22T13:41:43Z

Annach:

Plik:Struktura cząsteczki tert-butanolu i acetamidu.png

2015-05-22T13:41:38Z

Annach:

Plik:Widmo rozcieńczonego (czerwony) i stężonego (niebieski) roztworu butanolu z charakterystycznym szerokim pasmem pochodzącym od utworzonych międzycząsteczkowych wiązań wodorowych.png

2015-05-22T13:41:33Z

Annach: