Tekst źródłowy strony Pracownia Podstaw Biofizyki/PPB3

'''Mikroskopia konfokalna &mdash; zastosowanie w badaniach układów biologicznych na przykładzie chloroplastów'''

''Wariant 1: wyznaczenie struktury chloroplastów w warunkach naturalnych przy 6 mM stężeniu jonów magnezu (Mg<sup>2+</sup>)''

dr hab. Borys Kierdaszuk
==Wstęp==

W zjawisku fotosyntezy uczestniczą kompleksy białkowo-barwnikowe zlokalizowane na błonach tylakoidalnych w chloroplastach komórek roślinnych. Tylakoidy są wewnętrznymi błonami chloroplastów. Ścieśnione błony tylakoidalne tworzą grana (400-600 nm) i połączenia między granami zwane lamelami. Dotychczasowe badania prowadzone nad poznaniem budowy chloroplastów i procesów związanych z pochłanianiem kwantów światła doprowadziły do dokładnego poznania składu głównych kompleksów fotosyntetycznych (ang. ''photosyntetic systems'', PSI, PSII), kompleksów zbierającego światło (ang. ''light harvesting complexes'', LHCI, LHCII), cytochromu b6f (Cyt b6f) i syntazy ATP. Znane są również mechanizmy przemiany energii świetlnej w chemiczną i podstawowe mechanizmy regulujące proces fotosyntezy. 

Współczesna nauka coraz częściej podejmuje próbę odtworzenia rzeczywistych wymiarów i kształtów komórek i poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych oraz powiązania budowy strukturalnej komórki lub organelli z ich funkcją. W ostatnich latach, w związku z zastosowaniem metod tomografii elektronowej i mikroskopii sił atomowych (ang. ''atomic force microscopy'', AFM), rozgorzał spór o przestrzenną budowę błon tylakoidalnych. Istotny przyczynek do opracowania przestrzennych modeli chloroplastów wniosło zastosowanie fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (ang. ''confocal laser-scanning fluorescence microscopy'', CLSFM) oraz analiza indukowanego stężeniem magnezu procesu tworzenia gran i zmiany w strukturze chloroplastów pod wpływem stresu chłodu. Zaletą stosowania CLSFM w poznawaniu struktur biologicznych jest możliwość obserwacji zmian obiektów nie poddanych zabiegom utrwalania, czyli pomiar struktury biologicznej in situ.

Spadek temperatury, zmiany stężenia tlenu i soli mineralnych to podstawowe środowiskowe czynniki stresowe, które spowodowały powstanie w roślinach mechanizmów reakcji i przystosowania się. W szczególności mechanizmy przystosowawcze dotyczą także elastycznej regulacji reakcji fotosyntetycznych w odpowiedzi na zmienne warunki środowiska i są ściśle powiązane ze zmianami organizacji superkompleksów w błonach tylakoidalnych. 

Najlepiej poznany jest wpływ chłodu i stężenia jonów magnezu (Mg<sup>2+</sup>) na własności układów fotosyntetycznych. Chłód powoduje dezintegracje gran i pęcznienie chloroplastów, a także wzrost stężenia wolnych kwasów tłuszczowych, które mają również wpływ na oddziaływania pomiędzy kompleksami fotosyntetycznymi. Następuje zmniejszenie się wydzielania tlenu oraz uwalnianie manganu z kompleksu PSII. Ponadto badania widm emisji fluorescencji błon tylakoidalnych roślin przechłodzonych pokazały nagromadzenie się zagregowanych form LHCII. Powstałe zmiany są częściowo odwracalne poprzez fotoreaktywację pod wpływem oświetlania roślin słabym światłem w optymalnej temperaturze. Naturalne (~4 mM) stężenie kationów Mg<sup>2+</sup> stabilizuje struktury ścieśnione błon tylakoidowych (Rys. <xr id="fig:1"/>), które wraz z jego obniżeniem lub wzrostem stężenia anionów ulegają deagregacji. Związek pomiędzy zmianami w strukturze i przegrupowaniami kompleksów fotosyntetycznych w kontrolowanych warunkach stresowych nie jest jeszcze dobrze poznany. 

[[Plik:Różnice między stukturą nienaruszonych (naturalnych) chloroplastów groszku (pea) i fasolki (bean).png|thumb|500px|<figure id="fig:1"/>Różnice między stukturą nienaruszonych (naturalnych) chloroplastów groszku (pea) i fasolki (bean) otrzymaną na podstawie autofluorescencji chlorofilu w buforze C zawierajacym 15 mM NaCl i 4 mM MgCL<sub>2</sub>, zmierzonej za pomocą fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (ang. ''confocal laser-scanning fluorescence microscopy'', CLSFM). Każdy obrazek zawiera wynik rozplatania jednego środkowego obrazka z CLSFM. Skala = 2 &mu;m.]]

Ćwiczenie dotyczy badań biofizycznych struktury chloroplastów w nieobecności kationów Mg<sup>2+</sup> w roztworach symulujących ich naturalne środowisko. Celem jest zbadanie struktury przestrzennej chloroplastów za pomocą CLSFM z rozdzielczością optyczną mikroskopu wynikająca z limitu Abbego. Ćwiczenie to obejmuje także samodzielne przygotowanie preparatów na szkiełkach mikroskopowych oraz interpretację wpływu kationów Mg<sup>2+</sup> na podstawie porównania otrzymanej struktury z tą otrzymaną przez grupę wykonującą pierwszy wariant ćwiczenia.

==Wymagania do kolokwium wstępnego==

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego tj. forma pisemna czy ustna, pytania otwarte czy zamknięte &mdash; należy do prowadzącego ćwiczenie. 

Materiał z zakresu fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSFM) obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania ćwiczenia, przedstawiony został podczas wykładów „Spektroskopia molekularna” i „Fizyka atomów, cząsteczek i makrocząsteczek biologicznych”, a pewne jego rozszerzenie bądź ilustracja konkretnych zagadnień szczegółowych zawarta jest w dołączonej publikacji ([[Media:kierdaszuk.pdf|Załącznik 1]]<ref>Rumak I., Gieczewska K., Kierdaszuk B. Gruszecki W.I., Mostowska A., Mazur R., Garstka M., 3-D modelling of chloroplast structure under (Mg<sup>2+</sup>) magnesium ion treatment. Relationship between thylakoid membrane arrangement and stacking. Biochimica et Biophysica Acta, 1797, 1736–1748 (2010)</ref>) oraz opisie struktury optyki konfokalnej w typowym mikroskopie konfokalnym ([[Media:kierdaszuk2.jpg|Załącznik 2]]<ref>Opis struktury optyki konfokalnej w typowym mikroskopie konfokalnym.</ref>): 

Zagadnienia, które mogą pojawić się podczas kolokwium wstępnego:
#Absorpcja i emisja fotonów w przypadku cząsteczek biologicznych.
#Porównanie energii, częstości i długości fali fotonów absorbowanych i emitowanych przez dany fluorofor. Czynniki wpływające na emisję fotonów.
#Rola kompleksów chlorofilowo-białkowych w fotosyntezie.
#Rejestracja widma emisji i wzbudzenia fluorescencji.
#Zakresy długości fali pasm absorpcji oraz pasm emisji i wzbudzenia fluorescencji błon tylakoidowych i chloroplastów. Fluorofory odpowiedzialne za absorpcję i emisję fotonów w chloroplastach.
#Idea pomiarów za pomocą fluorescencyjnej laserowej konfokalnej mikroskopii skaningowej. Rola światła laserowego. 
#Pomiar konfokalny. 
#Metody skanowania przestrzennego. 
#Limit Abbego. 
#Zalety mikroskopu konfokalnego w porównaniu z mikroskopem niekonfokalnym.

==Wykonanie ćwiczenia==
===Przygotowanie próbek chloroplastów na szkiełkach mikroskopowych===
Nienaruszone chloroplasty są izolowane poprzez homogenizację liści groszku lub fasolki w zmrożonym buforze A (20 mM Tricine-NaOH, pH 7.5) zawierającym 330 mM sorbitol, 15 mM NaCl, 4 mM MgCL<sub>2</sub> i 40 mM askorbinianu. Po homogenizacji roztwór należy przesączyć przez czterokrotnie złożoną fizelinę. Przesącz jest wirowany przy 2000g przez 3 minuty. Homogenizację i sączenie wykonuje się w chłodni, a wirowanie schłodzonej do 4 &deg;C wirówce. W miarę możliwości materiał biologiczny należy trzymać w ciemności by uniknąć foto-uszkodzeń barwników. Otrzymany w ten sposób osad należy ostrożnie rozprowadzić w jak najmniejszej ilości buforu B (20 mM HEPES-NaOH pH 7.0) zawierającym 330 mM sorbitol, 15 mM NaCl i 4 mM MgCL<sub>2</sub>, a następnie natychmiast użyć w konfokalnym mikroskopie skaningowym (CLSM) do pomiaru (niżej). Chloroplasty uszkodzone (~20%) należy pominąć w badaniu CLSM. Stężenie chlorofilu (Chl) należy zmierzyć spektrofotometrycznie po ekstrakcji 25 ml roztworu chloroplastów w 80% acetonie w wodzie. Absorbancję należy zmierzyć w kuwecie 10x10 mm przy 652 nm wobec 80% acetonu jako roztworu odniesienia. Uwzględniając rozcieńczenie podczas ekstrakcji i współczynnik ekstynkcji z prawa Lamberta-Beera, stężenie Chl (mg/ml) otrzymujemy po pomnożeniu absorbancji przez współczynnik 11.6 mg/ml. Izolacja chloroplastów jest wykonywana w Instytucie Biochemii (Wydział Biologii UW). Potrzebne odczynniki i drobny sprzęt zostały zakupione z projektu badawczego. 


===Pomiary laserowej konfokalnej fluorescencyjnej mikroskopii skaningowej CLSFM oraz rekonstrukcja struktury przestrzennej chloroplastów ===

Izolowane nienaruszone chloroplasty (~30 &mu;g Chl ml<sup>-1</sup>) zawiesić w buforze C (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5) zawierającym 330 mM sorbitol, 6% (v/v) glycerol, 30 &mu;M DCMU (specyficzny inhibitor fotosyntezy blokujący miejsce wiązania plastochinonu w PSII) oraz 6 mM MgCL<sub>2</sub>. Po 10-minutowej inkubacji na lodzie w ciemnościach 15 &mu;l zawiesiny umieścić na warstwie poly-L-lizyny (1 mg/ml) imobilizowanej na szkiełku mikroskopowym. Wykonać obrazowanie próbek za pomocą konfokalnego fluorescencyjnego mikroskopu skaningowego (Nikon Eclipse Ti A1) wyposażonego w laser diodowy (<math>\lambda_\mathrm{exc}</math> 561.2 nm) i obiektyw olejowy Plan APOchromate VC 100x z aperturą NA 1.4. Emisja fluorescencji w mikroskopie jest zbierana za pomocą filtru 662-777 nm w zakresie emisji PSII, przy aperturze konfokalnej ustawionej na około jedną jednostkę Airego. Każdy preparat należy uważnie obejrzeć pod mikroskopem w świetle przechodzącym aby zlokalizować wyglądający na nienaruszony chloroplast. Rejestrowane są skany względem osi Z (optyczne warstwy 79-298 sztuk) stosując dodatkowe powiększenie 8x zawierające 512 x 512 pikseli i 12-bitowy kolor. Do analizy brane są skany tych chloroplastów, które mają kształt spłaszczonych kulek i nie są uszkodzone przez silne światło wzbudzające. Można je obejrzeć za pomocą programu NIS-Elements (Nicon). Po wykonaniu pomiarów, celem poprawienia relacji sygnał-szum sygnał emisyjny od chloroplastów jest rozplatany za pomocą programu AutoQuantX (Media Cybernetics) korzystając z domyślnych ustawień dla funkcji z którą następuje splot (point spread function). Program określa jaki byłby sygnał dyspersji od fluoroforów zlokalizowanych w hipotetycznych położeniach i odejmuje go od obrazu &mdash; po czym w kolejnych powtórzeniach stara się lepiej zlokalizować skupiska fluoroforów. Następnie dla tak przygotowanych plików danych, za pomocą programu Imaris (Bitplane) generowane są trójwymiarowe struktury przestrzenne chloroplastów (surface objects) z przykładowymi ustawieniami: surface area detail 0.03 &mu;m, local contrast 0.1 &mu;m, treshold 100, number of voxels 200. Działanie programu polega na objęciu wspólna powierzchnią sąsiadujących obszarów wykazujących silną fluorescencję. Powinno to w przybliżeniu odtworzyć strukturę błon (gran), w których zawarte są fotosystemy PSII. Pomiary i rekonstrukcje struktury przestrzennej są wykonywane odpowiednio w Pracowni Mikroskopowej i w Zakładzie Regulacji Metabolizmu (Instytutu Biochemii UW). 


==Wyniki==
#Przygotować próbki chloroplastów w obecności 6 mM jonów magnezu (Mg<sup>2+</sup>) na szkiełkach mikroskopowych według opisanej wyżej procedury. 
#Wykonać pomiary CLSFM na uprzednio przygotowanej aparaturze.
#Stosując odpowiednie oprogramowanie wykonać rekonstrukcję struktury przestrzennej chloroplastów.
#Porównać otrzymaną strukturę z tą otrzymaną przez grupę wykonującą drugi wariant tego ćwiczenia oraz zinterpretować wpływ kationów Mg<sup>2+</sup>.
<references/>