Metody Biofizyki Molekularnej/Mikroskopy ze skanującą sondą

Historia

Gerd Binnig oraz Heinrich Rohrer pod koniec 1978 roku rozpoczęli badania procesów wzrostu, struktury i własności elektrycznych bardzo cienkich warstw tlenków. Potrzebowali urządzenia dającego możliwość obserwacji powierzchni w skali ułamków nanometra. W tym celu w 1982 roku skonstruowali skaningowy mikroskop tunelowy, a w roku 1986 otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki.

W 1986 roku G. Binning, C.F Quate i Ch. Gerber skonstruowali mikroskop sił atomowych (AFM od ang. Atomic Force Microscope). Możliwości STM w zakresie obrazowania zapoczątkowały burzliwy rozwój nowej dziedziny zwanej mikroskopią sond skanujących (skaningowa mikroskopia bliskich oddziaływań).

Rodzaje mikroskopów ze skanującą sondą (SPM, Scanning Probe Microscopy)

• Skaningowy mikroskop tunelowy (STM, Scanning Tunneling Microscope) — wykorzystuje zjawisko tunelowania elektronów pomiędzy powierzchnią próbki a sondą.
• Mikroskop sił atomowych (AFM, Atomic Force Microscope) — mierzy siły działające na sondę.
• Mikroskop sił magnetycznych (MFM, Magnetic Force Microscope) — to mikroskop sił atomowych z sondą magnetyczną.
• Mikroskop sił tarcia (FFM, Friction Force Microscope).
• Mikroskop sił elektrostatycznych (EFM, Electrostatic Force Microscope).
• Mikroskop sond skanujących w bliskim polu optycznym.(SNOM, Scanning Near-Field Optical Microscopy) — sonda jest światłowód, a tunelują fotony emitowane przez próbkę.

Skaningowy mikroskop tunelowy (STM od ang. Scanning Tunneling Microscope)

Obraz powierzchni materiałów przewodzących ze zdolnością rozdzielczą rzędu pojedynczego atomu uzyskuje się wykorzystując zjawisko tunelowania elektronów. STM nie rejestruje fizycznej topografii próbki, ale mierzy obsadzone i nieobsadzone stany elektronowe blisko powierzchni Fermiego.

Uzyskiwanie obrazu metodą STM

1. Powierzchnia próbki jest wykonana z materiału przewodzącego prąd elektryczny.
2. Nad próbka znajduje się igła, której ruch możemy kontrolować.
3. Ramię trzymające igłę mocowane jest do aparatury poprzez skaner piezoelektryczny.
4. Skaner piezoelektryczny pod wpływem napięcia elektrycznego zmienia wymiary, a tym samym zmienia położenie igły przesuwając ją nad próbką.
5. Skanowanie kolejnych linii i punktów obrazu próbki odbywa się według z góry zadanego programu.

Metody uzyskiwania obrazu

Metoda stałej wysokości (ang. constant height method, CHM) igła porusza się na stałej wysokości nad próbką a aparatura rejestruje wyłącznie zmiany prądu tunelowego. Zastosowanie w przypadku próbek o równej powierzchni.

Metoda stałego prądu lub metoda stałej odległości od próbki (ang. constant current method, CCM, constant gap width mode, CGM) igła oddala się i przybliża do próbki.

Do obrazowania powierzchni próbki wykorzystuje się wielkość prądu tunelowego oraz napięcie sterujące wysokością igły.

Sonda (drut wolframowy lub Pt/Ir o średnicy 0,2-0,5 mm) zawiera na końcu kryształ ustawiony wierzchołkiem w stronę ostrza — zakończeniem sondy jest dokładnie jeden atom. Odległość sondy od powierzchni próbki jest rzędu kilku angstremów (do 1 nm). Przyłożone napięcie pomiędzy sondą a próbką (od ułamków do kilku woltów nie jest wystarczające do tego by elektron pokonał przyciąganie jonów metalu i oderwał się od ostrza igły, ale dzięki temu, że próbka jest w niewielkiej odległości od ostrza igły elektron przeskakuje przez zabroniony obszar (barierę potencjału) do badanej próbki w wyniku zjawiska tunelowania elektronów.

Najprostszą metodą otrzymania sondy do mikroskopu STM jest ucięcie drutu nożyczkami pod kątem 45°. Najczęściej sondy STM otrzymuje się poprzez elektrochemiczne trawienie (np. w 30% roztworze KOH), trawienie odsłania strukturę kryształu, a po selekcji można wybrać odpowiednie ostrze .

Elektrony tunelują z ostrza przez powietrze (lub próżnię) do próbki lub odwrotnie w zależności od kierunku przyłożonego napięcia. Wartość prądu tunelowego zależy silnie (wykładniczo) od szerokości bariery potencjału, w tym przypadku jest to odległość ostrza od najbliższych atomów (a nawet powłok atomowych) próbki. Typowe wartości prądu są rzędu 0,1-10 nA a analiza tak małych prądów wymaga dokładnej i niskoszumowej aparatury. Komputer analizuje i zapamiętuje mapę prądów tunelowych dla każdego punktu próbki i na tej podstawie tworzony jest później obraz próbki.

W przypadku badania substancji zbudowanych z różnych atomów wartość prądu zależy od siły wiązania elektronu przez atom (praca wyjścia). Pomiar tego prądu pozwala obrazować strukturę atomową powierzchni próbki. Wartość prądu tunelowego dostarcza informacji o wartości potencjału jaki czuje elektron opuszczający powierzchnię próbki. Zdolność rozdzielcza mikroskopu pozwala dostrzec poszczególne atomy.

Wadą mikroskopu STM jest ograniczenie możliwości obserwacji tylko do próbek wykonanych z przewodników.

Z kolei mikroskop sił magnetycznych (MFM, Magnetic Force Microscope) pracuje w przypadku próbek magnetycznych (dyski twarde, taśmy magnetyczne.

Mikroskop sił atomowych (atomic force microscopy,AFM)

Mikroskop sił atomowych ma większy wachlarz zastosowań niż skaningowy mikroskop tunelowy. Można stosować go do obrazowania przewodników, półprzewodników, izolatorów, wykonywać pomiary w cieczach, badać próbki biologiczne, w tym żywe preparaty w środowisku zbliżonym do naturalnego. Mikroskop AFM NIE korzysta z soczewek i źródła promieniowania (w znaczeniu typowym dla mikroskopów optycznych).

Zasada działania mikroskopu AFM

Skanowanie powierzchni próbki za pomocą cienkiego ostrza zamontowanego na sprężystym ramieniu Pomiar ugięcia ramienia proporcjonalnego do zmian topografii próbki Detekcja ruchu ramienia odbywa się za pomocą promienia laserowego skierowanego na koniec ramienia.

Budowa mikroskopu AFM przedstawiona jest na rys. Figure 1.

Budowa mikroskopu AFM. 1.Laser — źródło światła; 2.Lustro —odbija wiązkę laserową w kierunku fotodetektora; 3.Fotodetector —mierzy różnice w intensywności promieniowania i konweruje je na napięcie; 4.Wzmacniacz; 5.Rejestrator; 6.Próbka; 7.Ostrze sondy — wykonane z krzemu &mdahs; skanuje próbkę; 8.Sonda na sprężystym ramieniu — przesuwa się w trakcie skanowania próbki i odbija promieniowanie laserowe.

Siły van der Waalsa

Do odchylenia ramienia największy wkład wnoszą siły van der Waalsa wynikające z oddziaływań indukowanych szybkozmiennych dipoli pomiędzy ostrzem a próbką. Wypadkową siłę opisuje potencjał Lenarda-Jonesa:

[math]E(r) = -\frac{A}{r^6} +\frac{B}{r^{12}}[/math]

Tryb pracy mikroskopu AFM

• Tryb kontaktowy (contact mode).
• Tryb bezkontaktowy (non-contact mode).
• Tryb kontaktu przerywanego (tapping mode).

Tryb kontaktowy

• Ostrze jest w kontakcie z próbką.
• Pomiar sił odpychających (rzędu nN) pomiędzy ostrzem a próbką.
• Siły kontaktowe powodują wygięcie dźwigni proporcjonalne do zmian topografii próbki.
• Możliwość pracy:

1. Stała wysokość ramienia — detekcja ruchów ramienia — ramię naciska na próbkę siła zależną od topografii powierzchni, próbka jest utrzymywana na stałej wysokości (wada: otrze naciska z różną siłą — może to doprowadzić do zniszczenia próbki).
2. Stała siła — detekcja ruchu piezoelementu — ramię ma stałe ugięcie — w każdym punkcie nacisk z tą samą siła nie niszczy próbki (wada: nie da się wyeliminować sił bocznych, które mogą szarpiąc próbkę doprowadzić do jej uszkodzenia).

• Napięcie potrzebne do utrzymania stałej wysokości ramienia lub stałej siły wskazuje wysokość próbki.
• Eliminacja sił bocznych ma miejsce w bezkontaktowym trybie pracy.

Tryb bezkontaktowy

• Pomiar sil przyciągających pomiędzy ostrzem z próbką.
• Siły są mniejsze niż w trybie kontaktowym (pN).
• Dźwignia w odległości 10 – 100 nm od próbki, nie dotyka próbki.
• Dźwignia drga, w trakcie zbliżania do powierzchni próbki ulega zmianie amplituda drgań.
• Mikroskop zmienia położenie próbki w celu utrzymania stałej amplitudy drgań.
• Rejestracja zmiany położenia próbki (za pomocą elementu piezoelektrycznego) umożliwia odtworzenie powierzchni próbki
• Wada — nie można stosować do próbek ciekłych.

Tryb kontaktu przerywanego

• Ruch drgający ostrza z tak dobraną amplitudą, ze dziobie powierzchnię próbki. Częstotliwość drgań 50 000 – 500 000 drgań na sekundę.
• Siły związane z utrzymaniem stałej amplitudy drgań dźwigni powoduje tworzenie obrazu próbki.
• Zaleta — uniknięcie uszkodzenia powierzchni próbki związanego z tarciem i szarpaniem próbki.

Zastosowania AFM

Mikroskopy AFM stosuje się biologii, biofizyce, biotechnologii, inżynierii biomedycznej, nanobiotechnologii.

Wykorzystanie w analizie DNA, RNA ( z nanometrową rozdzielczością), kompleksów białek i kwasów nukleinowych, chromosomów, membran komórkowych, kryształów molekularnych polimerów, biomateriałów, wiązań ligand-receptor.

Pomiary:

• topograficzne,
• właściwości mechanicznych (elastyczność, adhezja, tarcie),
• spektroskopia pojedynczych molekuł.

w celu:

• obrazowania komórek i mniejszych obiektów,
• badania ilościowego odziaływań molekularnych w systemach biologicznych,
• badania ilościowego elektrycznego ładunku powierzchniowego.

W przypadku pomiaru właściwości rejestruje się krzywe siła–odległość.

Zalety AFM

• Możliwość pomiaru struktury powierzchni od rozmiarów atomowych do 0.1 mm.
• Rozdzielczość w poziomie ograniczona przez rozmiar ostrza (2-3 nm).
• Rozdzielczość 0,01 nm w pionie.

AFM a inne poznane techniki mikroskopowe

• AFM a STM (scanning tunneling microscope) — Możliwość pomiarów dla przewodników i izolatorów.
• AFM a SEM (scanning electron microscope) — Lepsza kontrast topograficzny.
• AFM a TEM (transmission electron microscope) — Tańszy i prostszy sposób przygotowania próbki.

Problem drgań zewnętrznych

Czułość na drgania zewnętrzne. Drgania te są co najmniej 1000 razy większe niż odległość sondy od powierzchni próbki. Źródłami drgań są: ruch samochodowy, kroki czy nawet hałas. Aby nie dochodziło do niekontrolowanych zderzeń sondy z powierzchnią próbki potrzebne są dodatkowe systemy tłumiące drgania. Istniejące obecnie systemy antywibracyjne pozwalają działać urządzeniom nawet na wyższych piętrach budynków.

Twórcy pierwszego skaningowego mikroskopu tunelowego do wytłumienia drgań wykorzystali zjawisko unoszenia się nadprzewodnika w polu magnetycznym — umieścili swój mikroskop na nadprzewodzącej czaszy ołowianej wypychanej na zewnątrz z niejednorodnego pola magnetycznego.

Dalszy rozwój AFM

• Zwiększanie rozdzielczości poprzez projektowanie i zastosowanie węższych ostrzy.
• Dostosowanie ostrzy do próbek biologicznych (mniejsze uszkodzenia próbki (mniejsze siły lepkości).
• Redukcja szumów.