Pracownia Biofizyki dla Zaawansowanych/Ćw 4/I: Różnice pomiędzy wersjami

Z Brain-wiki
 
Linia 220: Linia 220:
 
#J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
 
#J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
 
#Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
 
#Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
#A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia [[FZ:Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki,
+
#A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia [[Pracownia_Podstaw_Biofizyki/PPB4d|„Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne”]] — Pracownia Podstaw Biofizyki,
 
#Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
 
#Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
 
#C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.
 
#C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.

Aktualna wersja na dzień 14:06, 22 maj 2015

Badania zwijania i rozwijania białek w funkcji stężenia czynnika denaturującego metodą spektroskopii emisyjnej

dr Beata Wielgus-Kutrowska

Wstęp

W każdej komórce znajdują się tysiące różnorodnych białek o wyspecjalizowanych funkcjach współpracujących ze sobą. Należą do nich enzymy, białka strukturalne, transportujące, motoryczne, zapasowe, sygnałowe, receptorowe, białka regulujące geny i wiele innych, specyficznych dla konkretnego organizmu i warunków w jakich żyje (np. zapobiegające zamarzaniu ryb). Pomimo tak różnorodnych funkcji, wszystkie białka zbudowane są z takich samych aminokwasów (jest ich około 20). To czym się różnią to kolejności aminokwasów w łańcuchu białkowym, jego długość i struktura przestrzenna makrocząsteczki aktywnej biologicznie. Struktura trójwymiarowa biomolekuły ma fundamentalne znaczenie. Dopiero po jej przyjęciu białko może prawidłowo pełnić swoją funkcję. Natomiast jeśli po utworzeniu, w procesie ekspresji, odpowiedniego łańcucha białkowego, nie dojdzie do jego właściwego skręcenia staje się ono bezużyteczne, a czasem toksyczne dla organizmu. Dobrym przykładem są priony, które występują powszechnie w każdym organizmie i są niegroźne dopóki nie zmienią konformacji, stając się białkiem prionowym infekcyjnym. Priony toksyczne i niegroźne mają identyczną strukturę pierwszorzędową, ale różnią się strukturą drugorzędową (białko PrPC nie wywołujące choroby posiada trzy α-helisy i dwie tzw. β-nici, a patogenne białko PrPSc zawiera przewagę struktury harmonijki β), co wiąże się z odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi — PrPC jest rozpuszczalne w wodzie, natomiast PrPSc jest nierozpuszczalne.

Tak więc aby białka pełniły prawidłowo swoją rolę muszą przybrać właściwą konformację przestrzenną. Pomimo ogromnej różnorodności konformacji białek, można znaleźć pewne cechy wspólne. Jest to tak zwana struktura drugorzędowa, wśród której najczęściej występującymi elementami są β-kartki, α-helisy i fragmenty nieustrukturyzowane (z dokładnym omówieniem tych struktur spotkali się Państwo na wcześniejszych wykładach).

Prawidłowy przebieg procesu przyjmowania właściwej konformacji przestrzennej (proces zwijania, fałdowania, ang. folding) decyduje o tym, czy białko będzie pełnić swoje funkcje. Nic więc dziwnego, że zwijanie białek jest jednym z kluczowych procesów badanych obecnie przez różnorodne zespoły naukowe, wykorzystujące zaawansowane techniki biofizyczne, takie jak spektroskopia (absorpcyjna, emisyjna, dichroizmu kołowego), różnicowa kalorymetria skanująca, spektrometria masowa i inne.

Trzy spośród 20 aminokwasów budujących białka posiadają właściwości emisyjne. Są to tryptofan, fenyloalanina i tyrozyna. Jednak tylko tryptofan reaguje zmianą intensywności emisji i przesunięcia jej maksimum na zmianę otoczenia, występującą w trakcie zwijania białka, a związaną z przesuwaniem się tryptofanu ze środowiska wodnego, hydrofilowego, do hydrofobowego we wnętrzu cząsteczki (patrz również opis ćwiczenia „Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne” — Pracownia Podstaw Biofizyki). Wykonawszy pomiary zmiany intensywności emisji białka, możemy uzyskać informacje na temat etapów zwijania i ustalić, czy jest to proces jednoetapowy, związany z kolapsem do struktury natywnej, korzystnej energetycznie, czy proces przebiega wieloetapowo — np. najpierw tworzą się struktury drugorzędowe, które następnie zwijają się tworząc bardziej skomplikowane układy.

Cel ćwiczenia

W ćwiczeniu wykorzystamy metodę spektrometrii emisyjnej do badania procesu zwijania i rozwijania wybranego białka. Wykorzystamy zjawisko zmian emisji w zakresie UV białka oraz znacznika fluorescencyjnego, związanych ze zmiana struktury.

Celem ćwiczenia jest: Przeprowadzenie w funkcji zmieniającego się stężenia denaturanta — chlorowodorku guanidyny pomiarów fluorescencji samego białka (obserwacja przesuwania się maksimum emisji białka i zmian intensywności emisji w wybranej długości fali) oraz znacznika fluorescencyjnego (BisANS), będącego wskaźnikiem obecności struktur pośrednich procesu zwijania.

Obserwować będziemy:

  1. Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zwiększania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze nie zawierającym denaturanta) — rozwijanie białka.
  2. Zmianę naturalnej emisji białka w trakcie zmniejszania stężenia denaturanta (dla biomolekuły znajdującej się wyjściowo w roztworze denaturanta o maksymalnym stężeniu) — zwijanie białka.
  3. Zmianę emisji znacznika fluorescencyjnego, dla którego intensywność emisji zależy od stanu białka i przybiera wartość maksymalną dla stanu tzw. stopionej globuli (ang. molten globule). Pomiary te przeprowadzimy zarówno w funkcji zwijania jak i rozwijania białka.
  4. Na podstawie przeprowadzonych pomiarów:
    1. określimy właściwości emisyjne białka w stanie rozwiniętym i zwiniętym,
    2. scharakteryzujemy procesy zwijania i rozwijania białka,
    3. stwierdzimy czy proces zwijania jest procesem odwracalnym,
    4. dokonamy krytycznej dyskusji wyników.

Materiały stosowane w pracy i metody

Białko można denaturować poprzez podwyższenie temperatury lub używając detergentów. Są to jednak procesy trudno odwracalne. Powszechnie wykorzystuje się chaotropy, czyli związki chemiczne, które przez zmianę otoczenia łańcucha polipeptydowego wpływają na stopień rozwinięcia białka. Przedstawicielem tej grupy jest 'chlorowodorek guanidyny (CH5N3∙HCl), który w dużym stężeniu niszczy strukturę przestrzenna biomolekuł. Zmniejszenie stężenia GdnHCl powoduje powrót do struktury aktywnej biologicznie.

4.4’dianilino 1, 1’-binaftaleno 5.5’-kwas disulfonowy (BisANS) jest substancją przyłączającą się do hydrofobowych miejsc w strukturze białka. Po przyłączeniu BisANS wykazuje zdolność fluorescencji przy wzbudzeniu 420 nm z maksimum emisji w 490 nm. Znacznik ten stosuje się do monitorowania powstawania intermediatów (stanów pośrednich), dla których powierzchnia hydrofobowa jest bardziej dostępna niż w przypadku natywnej cząsteczki białka (jest to tak zwana struktura stopionej globuli, dla której główny łańcuch białkowy ma właściwa konformację, natomiast łańcuchy boczne nie są jeszcze dobrze ustrukturyzowane).

Lizozym to niewielkie białko złożone z 129 aminokwasów, o masie 14,4 kDa. Jest to enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii.

W modelu jednoetapowym przejścia ze struktury natywnej do zdenaturowanej

[math]N\Rightarrow D[/math]

można wyznaczyć ilość frakcji natywnej w funkcji stężenia denaturanta. Wykorzystuje się w tym celu zależność fluorescencji w wybranej długości fali od stężenia czynnika denaturującego, przy założeniu, że całkowita fluorescencja jest sumą fluorescencji składników:

[math]y=y_Nf_N+y_Df_D[/math]

gdzie [math]y[/math] — całkowita intensywność fluorescencji, [math]y_N[/math] — jednostkowa fluorescencja frakcji natywnej, [math]y_D[/math] — jednostkowa fluorescencja frakcji zdenaturowanej, [math]f_N[/math] — ułamek frakcji natywnej, [math]f_D[/math] — ułamek frakcji zdenaturowanej.

Po przekształceniach otrzymujemy:

[math]f_D = \frac{y-y_N}{y_D-y_N}\,[/math]
[math]f_N = \frac{y_D-y}{y_D-y_N}[/math]

Stąd możemy wyznaczyć procentowy udział frakcji natywnej i zdenaturowanej w funkcji stężenia denaturanta., a następnie energię swobodną [math]\Delta G[/math]

[math]K = e^{-\frac{\Delta G}{RT}} = \frac{f_D}{f_N}[/math]
[math] \Delta G = -RT\mathrm{ln} K = -RT \mathrm{ln}\frac{f_D}{f_N} [/math],

gdzie [math]R[/math] — stała gazowa [math]\unit{8,31 }{\frac{J}{mol\,K}}[/math], [math]T[/math] — temperatura [K].

Warunki przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia

Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego należy do prowadzącego ćwiczenie. Materiał z zakresu spektroskopii emisyjnej obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania części eksperymentalnej ćwiczenia został przedstawiony w niniejszej instrukcji, podczas wykładów „Spektroskopia Molekularna”, „Biologia Molekularna” oraz w umieszczonej na końcu instrukcji bibliografii.

Na kolokwium wstępnym mogą pojawić się następujące zagadnienia:

  1. Spektroskopia emisyjna. Schemat Jabłońskiego. Co to jest efekt filtra wewnętrznego?
  2. Budowa spektrofluorymetru i technika pomiarów fluorescencyjnych (widma wzbudzenia i emisji) w zakresie UW.
  3. Właściwości fluorescencyjne białek. Jakie aminokwasy i dlaczego decydują o fluorescencji białek? Zakres fal wzbudzenia i obserwacji. Zależność intensywności emisji od charakteru otoczenia (polarne, niepolarne).
  4. Zwijanie białek. Modele procesu, co się dzieje jeśli białka nie zwijają się prawidłowo.
  5. Rola odczynników stosowanych w badaniach stacjonarnych zwijania (GdnHCl, mocznik, BisANS).

Wykonanie eksperymentu

W pomiarach stężenie lizozymu wynosić będzie około 7 μg/μl.

Do dyspozycji mamy:

  1. 10 mM bufor fosforanowy pH 7.0 (bufor A),
  2. 10 mM bufor fosforanowy zawierający GdnHCl o stężeniu 6 M pH 7.0 (bufor B),
  3. roztwór Bis ANS o stężeniu 2 mM,
  4. roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze A,
  5. roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml w buforze B.

Etapy wykonania eksperymentu:

Dzień 1 i 2

  1. Przygotowanie roztworów wyjściowych o zmiennym stężeniu GdnHCl w zakresie 0 - 4M i objętości 10 ml zgodnie z tabelą:
    Stężenie GdnHCl [M] Objętość bufora A [ml] Objętość bufora B [ml]
    0 10 0
    0.2 9.67 0.33
    0.4 9.34 0.66
    0.6 9.01 0.99
    0.8 8.67 1.33
    1 8.34 1.66
    1.5 7.50 2.50
    2 6.67 3.33
    2.5 5.84 4.16
    3 5 5
    4 3.34 6.66
  2. Pobieramy po 1.3 ml buforu o wzrastającym stężeniu GdnHCl i wykonujemy pomiar widm w zakresie 300 – 450 nm przy wzbudzeniu w 280 nm i szerokości szczeliny 2.5 nm.
  3. Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze A o stężeniu 1 mg/ml.
  4. Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo zwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.
  5. Pobieramy po 1.3 ml każdego roztworu i dodajemy do niego 9.1 μl białka w buforze B o stężeniu 1 mg/ml.
  6. Wykonujemy pomiar widm białka wyjściowo rozwiniętego podczas rozwijania w roztworach o zwiększającym się stężeniu GdnHCl.

Dzień 3

  1. Opracowanie wyników pomiarów:
    1. Wykonanie wykresów dla zwiększającego się stężenia GdnHCl w wybranej długości fali dla procesu zwijania i rozwijania białka.
    2. Sprawdzenie jak przesuwa się maksimum emisji w funkcji stężenia GdnHCl dla procesu zwijania i rozwijania białka (proszę pamiętać o odjęciu w przypadku a. i b. widma tła!).

Dzień 4 i 5

  1. Przygotowanie roztworów zgodnie z poniższą tabelą:
    Stężenie GdnHCl [M] Objętość bufora A [ml] Objętość bufora B [ml] Objętość 2 mM
    roztworu BisANS [ml]
    0 9 0 1
    0.2 8.67 0.33 1
    0.4 8.34 0.66 1
    0.6 8.01 0.99 1
    0.8 7.67 1.33 1
    1 7.34 1.66 1
    1.5 6.50 2.50 1
    2 5.67 3.33 1
    2.5 4.84 4.16 1
    3 4 5 1
    4 2.34 6.66 1
  1. Pobieramy po 1.3 ml każdego z przygotowanych roztworów buforu.
  2. Przygotowanie próbek białka analogicznie jak w przypadku poprzednich pomiarów.
  3. Pomiar fluorescencji BisANS w roztworach białka o różnym stężeniu GdnHCl (długość fali wzbudzenia 394 nm, a obserwacji 478 nm, przy szerokości szczeliny 5.0 nm).

Dzień 5 i 6 — Opracowanie wyników pomiarów.

  1. Wykonanie wykresów emisji BisANS dla zwiększającego się stężenia GdnHCl, w wybranej długości fali, dla obserwacji zwijania i rozwijania białka (wykonując wykres proszę uwzględnić poprawkę związaną z rozcieńczeniem roztworu GdnHCl poprzez dodanie BisANS).
  2. Wyznaczenie zawartości frakcji natywnej w eksperymentach zwijania i rozwijania białka.
  3. Wyznaczenie energii swobodnej [math]\Delta G[/math].
  4. Wyznaczenie zakresu, w którym białko ma formę stopionej globuli.
  5. Sprawdzenie czy proces zwijania jest odwracalny, czy pojawia się histereza.
  6. Interpretacja uzyskanych wyników.

Literatura:

  1. J. R. Lakowicz “Principles of fluorescence spectroscopy”,
  2. Materialy z wykładów “Spektroskopia molekularna”, “Biologia Molekularna”, “Biochemia”,
  3. A. Modrak-Wójcik — opis ćwiczenia „Denaturacja albuminy z krwi wołu pod wpływem chlorowodorku guanidyny — pomiary fluorescencyjne” — Pracownia Podstaw Biofizyki,
  4. Z. Kęcki „Podstawy Spektroskopii Molekularnej”,
  5. C. N. Pace „Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Curves” Methods in Enzymology, vol. 131, p. 266 – 274.