Pracownia Biologii Molekularnej II/Wstęp

Pracownia Biologii Molekularnej

Część II

Ekspresja i oczyszczanie białek

Wstęp

Celem II części Pracowni Biologii Molekularnej jest zapoznanie się z pełną procedurą uzyskiwania i oczyszczania białek. Zajęcia są podzielone na trzy etapy:

1. ekspresja białka w bakteriach Escherichia coli,
2. oczyszczanie,
3. ocena czystości i stężenia uzyskanego produktu.

Podstawą zaliczenia Pracowni są wypełnione karty problemowe, sprawdzające wiedzę studentów niezbędną do wykonania ćwiczeń oraz karta wynikowa podsumowująca wykonane eksperymenty.

Obiekt

Obiektem, który będziemy eksprymować w bakteriach, izolować i oczyszczać jest wybrane białko z dołączoną 6-ścio histydynową etykietą umożliwiającą oczyszczanie na kolumnie powinowactwa do jonów niklu.

Namnażanie białka w komórkach bakterii Escherichia Coli

Celem pierwszej części ćwiczenia jest namnożenie białka w komórkach bakteryjnych E. coli. W tym celu zostaną przygotowane pożywki (płynna LB i stała LB+agar) zawierające antybiotyk. Hodowane na nich bakterie E. coli zawierają plazmid białka z genem oporności na ampicylinę.

Pożywki do hodowli

Do płynnej hodowli bakteryjnej zastosowana zostanie pożywka LB Broth (firmy Biocorp) zawierająca chlorek sodu zapewniający odpowiednie stężenie elektrolitów, ekstrakt drożdżowy i Trypton, które są źródłem związków chemicznych umożliwiających prawidłowy i stosukowo szybki wzrost kultur bakteryjnych E. coli.

W przypadku hodowli stałych dodatkowo dodany zostanie agar, wielocukier, który w temperaturze pokojowej polimeryzuje tworząc żel. Wysterylizowaną pożywkę stałą przechowujemy w lodówce rozgrzewając przed wylaniem na szalki.

Zarówno do hodowli płynnej jak i stałej zostanie dodana ampicylina umożliwiająca wybiórczy wzrost bakterii zawierających gen oporności na ten antybiotyk. Dzięki temu następuje zahamowanie wzrostu bakterii niezawierających genu oporności, a tym samym plazmidu białka.

Przygotowane pożywki będą sterylizowane przez asystenta parą wodną w autoklawie.

Rozwój hodowli bakteryjnych

Wzrost bakterii zawierających plazmid wybranego białka będzie następował w trzech etapach:

1. Hodowla na pożywce
2. Hodowla nocna w pożywce płynnej
3. Hodowla dzienna w pożywce

Kontrola wzrostu bakterii w pożywce płynnej w 3-cim etapie pracy będzie się odbywać poprzez pomiar absorpcji hodowli w kuwecie przy długości fali 600 nm

Ekspresja w systemie T7

Wektory ekspresyjne zawierające gen wybranego białka są wprowadzane do bakterii w procesie transformacji. Umieszczenie dodatkowo genu oporności na antybiotyk umożliwia wyselekcjonowanie bakterii zawierających transformowany plazmid.

Istnieje kilka typów systemów ekspresyjnych, a wśród nich system T7, w którym wektor ekspresyjny pRSET został zastosowany w celu ekspresji wybranego białka w E. coli.

System ekspresji T7 uruchamiany jest przez dodanie do pożywki induktora — izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w momencie gdy bakterie osiągną odpowiednią fazę wzrostu (log). IPTG, po dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąże się do represora laktozowego, powodując jego inaktywację. Powoduje to uruchomienie produkcji polimerazy RNA z faga T7, a następnie eksprymowanego białka.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym białek w warunkach denaturujących

Wiadomości podstawowe

Do oceniania masy i zawartości zanieczyszczeń w próbce białek lub kwasów nukleinowych stosuje się techniki elektroforetyczne wykorzystujące właściwość rozdzielania naładowanych składników mieszanin pod wpływem pola elektrycznego w specjalnie przygotowanych żelach poliakryloamidowych lub agarozowych. Żele pełnią rolę sita molekularnego przez które, dzięki przyłożonemu polu elektrycznemu cząsteczki migrują z szybkością zależną od ich wielkości, kształtu i ładunku.

W zależności od konkretnego problemu można zastosować różne rodzaje elektroforezy, w tym elektroforezę denaturująca (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel elektrophoresis). Dodajemy wtedy do próbki białka siarczan dodecylu sodu (SDS) — silny detergent anionowy, który rozbija cząsteczki białka na podjednostki, opłaszcza je, nadając formę liniową i silny ujemny ładunek, niezależny od ładunku cząsteczki w stanie natywnym. Szybkość migracji w żelu w obecności SDS zależy głównie od wielkości cząsteczki białka.

Pod wpływem przyłożonego napięcia w granicach 100 — 300 V cząsteczki mieszaniny ulegają rozdziałowi, po którym są lokalizowane poprzez barwienie (np. solami srebra, kumasyną, bromkiem etydyny) i identyfikowane przy użyciu odpowiedniej metody detekcji.

Celem ćwiczenia jest wykonanie denaturującej elektroforezy białkowej (SDS-PAGE) z zastosowaniem żeli poliakryloamidowych tworzonych dzięki polimeryzacji monomerów akryloamidowych w długie łańcuchy, które następnie są łączone kowalencyjnie przez N,N’-metyleno-bisakrylamid. Proces ten zachodzi w obecności nadsiarczanu amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED).

Uwaga! Przy przygotowywaniu żeli należy zachować szczególna ostrożność ponieważ akryloamidy używane do ich przygotowania są neurotoksyczne. Należy pracować w rękawiczkach, pod wyciągiem, uważając aby nie rozlać mieszaniny akryloamidu z N,N’-metyleno-bisakrylamidem. Unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi.

Wielkość porów zależy od stężenia akryloamidu. Przyjęto konwencję w której żele są nazywane w zależności od stężenia procentowego całkowitej ilości akryloamidu i bis-akryloamidu [%T].

Stęzenie procentowe wskazuje jaka jest względna wielkość porów. Wielkość porów zmniejsza się wraz ze zwiększaniem stężenia akryloamidów.

W ćwiczeniu zastosujemy nieciągły gradient stężenia żelu, mianowicie układ będzie składał się z dwóch żeli — 4%-ego ściągającego (żel górny, który koncentruje nakładaną próbkę w cienkie pasmo) i 12%-ego separującego (żel dolny, w którym następuje rozdział białek w zależności od ich masy).

Rola niektórych odczynników stosowanych w elektroforezie denaturującej

W typowej elektroforezie denaturującej znajdują zastosowanie następujące odczynniki:

• bufory o określonym pH, utrzymujące ładunek cząsteczek białka i umożliwiające ich stała migrację w kierunku elektrody, aż do zakończenia elektroforezy,
• siarczan dodecylu sodu (SDS) — detergent anionowy o ujemnym ładunku w szerokim zakresie pH rozbijajacy białka złożone na podjednostki i nadający mu silny ładunek ujemny,
• 2-merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT) — silne reduktory rozrywające wiązania dwusiarczkowe,
• glicerol — zagęszczajscy próbki, co zapobiega ich dyfuzji w czasie nakładania do studzienek,
• błekit bromofenolowy — zabarwiający próbkę białka,
• kumazyna (Coomassie Brilliant Blue R250, CBB) — barwnik stosowany do zabarwiania żelu po zakończeniu elektroforezy,
• żel ściągający 4.0 % i separujący 12.0%.

Oczyszczanie bialek metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC, Immobilised Metal Affinity Chromatography)

Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (tu: niklu) jest jedną z najprostrzych jednoetapowych metod oczyszczania białek, przy zastosowaniu której, szczególnie w przypadku białek w formie zdenaturowanej, uzyskuje się próbki o wysokiej czystości.

Jony niklu są stabilizowane i silnie wiązane ze złożem za pomocą mostka zbudowanego z cząsteczek kwasu nitrylooctowego (NTA). Umożliwia to związanie białka z ogonem histydynowym do niklu i dalej złoża. Po związaniu bialka wymywa się zanieczyszczenia, które nie związały sięz niklem. Ostatnim etapem jest wymycie białka za pomocą buforu do elucji zawierającego imidazol, w którym, pod wpływem konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy histydyną a imidazolem, białko odczepia się od kolumny.

Procedura umożliwia oczyszczenie białka do stanu 95% homogenności w jednym etapie. Kolumna Ni-NTA jest wypełniona złożem zawierającym Ni-NTA połaczonym z sefarozą. Jest stabilna i łatwa do przechowywania.

W ćwiczeniu wykorzystamy kolumienki wirownicze umożliwiające oczyszczenie do 150 μg białka z lizatu komórkowego z wykorzystaniem mikrowirówki.

Procedura oczyszczania białek metodą powinowactwa do unieruchomionych jonów metali składa się z następujących etapów:

1. Nałożenie białka na kolumnę zawierającą złoże połączone z Ni-NTA.
2. Odseparowanie białka oczyszczonego od zanieczyszczeń niespecyficznie związanych ze złożem, poprzez przemycie buforem zawierającym imidazol o stężeniu około 20 mM.
3. Wymycie właściwego białka buforem do elucji zawierającym imidazol o stężeniu 250 mM.

Rola imidazolu

Pierścień imidazolowy jest fragmentem histydyny, która wiąże się na kolumnie do unieruchomionego jonu niklu. Imidazol konkuruje z histydyną i w niewielkim stężeniu powoduje odłączanie niespecyficznie związanych ze złożem białek. Przy niskim stężeniu imidazolu białko z ogonem sześciohistydynowym nadal pozostaje przyłączone do kolumny. Dopiero znacznie podwyższone stężenie imidazolu powoduje odłączenie białka będącego obiektem oczyszczania.

Wydajność oczyszczania dodatkowo podnoszą:

Betamerkaptoetanol zapobiegający tworzeniu mostków siarczkowych pomiędzy białkiem z ogonem histydynowym a innymi białkami, które chcemy usunąć.

Detergenty (Triton X-100, Tween 20) lub NaCl redukujące niespecyficzne oddziaływania białek ze złożem oparte na oddziaływaniach hydrofobowych bądź jonowych.

znaczanie zawartości i stężenia białek w próbkach

Metoda Melanii Bradford

Metoda Melanii M. Bradford wykorzystuje fakt przesunięcia maksimum absorpcji roztworu kumazyny (Coomassie Brillant Blue) z 465 nm do 595 nm po związaniu z białkiem. Cząsteczka barwnika oddziałuje poprzez grupy SO3ˉ z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasowymi. Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, w mniejszym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny. W środowisku kwaśnym kumazyna ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze.

Metoda spektroskopowa

Spektroskopowe metody oznaczania stężeń białek opierają się na właściwościach absorpcyjnych naturalnych chromoforów występujących w białkach takich jak tyrozyna, tryptofan i fenyloalanina, które absorbują promieniowanie ultrafioletowe w zakresie 240 — 340 nm. Znając zawartość tych aminokwasów w białku możemy wyznaczyć współczynnik ekstynkcji i, korzystając z prawa Lamberta-Beera, stężenie białek w próbce. Dla krótszych fal (ok. 200 nm) absorbują wiązania peptydowe w białkach. Znając współczynnik ekstynkcji dla długości fali w tym zakresie możemy również wyznaczyć stężenie białka. Metoda ta jest jednak znacznie rzadziej stosowana ze względu na często spotykaną absorpcję buforów w tym zakresie.