Pracownia Podstaw Biofizyki/PPB8

Z Brain-wiki

Spektroskopia 1H NMR — asocjacja między zasadą modyfikowaną a zasadami potencjalnie komplementarnymi na przykładzie N6-metoksyadeniny

Wariant 1: wyznaczenie selektywnej asocjacji i stałej asocjacji dla kompleksu z cytydyną

dr hab. Borys Kierdaszuk

Wstęp

Molekularną podstawą specyficzności między zasadami kwasów nukleinowych jest precyzyjny system cyklicznych wiązań wodorowych tworzonych miedzy zasadami purynowymi i pirymidynowymi. Wiązania te są specyficzne, ponieważ adenina tworzy pary komplementarne tylko z uracylem (tyminą) a guanina tylko z cytozyną i obrazują komplementarność znalezioną przez Watsona i Cricka w strukturze DNA. W oryginalnej pracy z 1953 roku autorzy postulowali, że każda para A=T i G=C połączona jest dwoma wiązaniami wodorowymi, tymczasem trzy lata później Pauling i Corey wykazali obecność trzech wiązań wodorowych miedzy G i C.

Komplementarność miedzy zasadami kwasów nukleinowych może być zakłócona przez modyfikacje chemiczne zasad, które są wywołane przez środowiskowe mutageny chemiczne pochodzące z zanieczyszczeń. Przykładem takiej modyfikacji jest N6-metoxyadenozyna (OMe6A, Schemat Figure 1), produkt reakcji (transaminacji) adenozyny (A) z mutagenem chemicznym metoxyaminą (NH2OCH3). OMe6A jest promutagenem w różnych układach prokariotycznych i eukariotycznych, np. w drożdżach, Escherichia coli, Neurospora crassa oraz fibroblastach chomika. Promutagenne własności tego analogu są także potwierdzone in vitro poprzez jego dualną funkcjonalność w układach polimeraz RNA i DNA, gdzie OMe6A zachowuje jak A lub G. Dualne własności funkcjonalne OMe6A w tworzeniu par komplementarnych z niemodyfikowanymi zasadami kwasów nukleinowych odzwierciedlone są w jej równowadze tautomerycznej amino — imino (Schemat Figure 1), gdzie grupa N6-OCH3 znajduje się w konformacji syn względem azotu N(1) pierścienia puryny. Równowaga tautomeryczna silnie zależy od środowiska (rozpuszczalnika) i zmienia się od ~90% zawartości formy aminowej w czterochlorku węgla do ~90% formy iminowej w środowisku wodnym. Ma ona kluczowe znaczenie dla tworzenia błędnej pary (ang. miss-pairing) z potencjalnie komplementarną C oraz molekularnego mechanizmu powstawania mutacji punktowych typu tranzycji A → G wywołanej obecnością OMe6A w mutagenezie środowiskowej indukowanej metoxyaminą.

Równowaga tautomeryczna amino-imino oraz rotameryczna syn-anti grupy egzocyklicznej N6-OMe względem N(1) pierścienia purynowego. Z powodu przeszkody sterycznej między O6CH3 i N(7) pierścienia purynowego, rotamer anti jest mniej prawdopodobny.

Pierwszy wariant ćwiczenia dotyczy wyznaczenia selektywnej asocjacji i stałych autoasocjacji amino-OMe6A, imino-OMe6A i C oraz heteroasocjacji OMe6A:C za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego jądra 1H (ang. 1H Nuclear Magnetic Resonace, 1H NMR). Spektroskopia 1H NMR bardzo dobrze nadaje się do zbadania równowagi tautomerycznej amino-iminowej oraz asocjacji z udziałem wiązań wodorowych, ponieważ w każdym z tych zjawisk atom wodoru 1H znajduje się w zmiennym otoczeniu chemicznym wpływającym na własności sygnału rezonansowego. Równowaga tautomeryczna jest odzwierciedlona w formie dwóch zestawów sygnałów 1H NMR o stałej proporcji między integralnymi natężeniami względnymi odpowiadającej populacji poszczególnych tautomerów (Rysunek Figure 2). Natomiast tworzeniu wiązań wodorowych z udziałem grup =N(1)-H lub =N6-H w tautomerach odpowiednio imino- OMe6A lub amino-OMe6A oraz grypy aminowej -NH2 w C powinno towarzyszyć przesuniecie sygnału rezonansowego 1H NMR.

Typowe widmo 1H NMR pochodnej OMe6A in C2HCl3 zawierające dwa zestawy sygnałów pochodzących od form tautomerycznych amino i imino. Numery odpowiadają różnym jądrom atomów wodoru w cząsteczce. Wyższy sygnał w każdej parze odpowiada formie amino a niższy formie imino. Przesunięcia chemiczne są wyznaczone względem (Me)4Si.

Wymagania dotyczące kolokwium wstępnego

  1. Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego tj. forma pisemna czy ustna, pytania otwarte czy zamknięte — należy do prowadzącego ćwiczenie.
  2. Materiał z zakresu spektroskopii NMR obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania ćwiczenia, przedstawiony został podczas wykładów „Spektroskopia molekularna” i „Fizyka atomów, cząsteczek i makrocząsteczek biologicznych”, a pewne jego rozszerzenie bądź ilustracja konkretnych zagadnień szczegółowych zawarta jest w dołączonych do opisu publikacjach (patrz poniżej). Chętnym pragnącym poszerzyć wiedzę nt. zastosowania spektroskopii NMR polecamy następującą pozycję literaturową: W. Zieliński i A. Rajca „Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych”(praca zbiorowa).

Publikacje dotycząca ćwiczenia:

  1. R. Stolarski, B. Kierdaszuk, C-E Hagberg, D. Shugar, Hydroxylamine and Methoxyamine Mutagenesis: Displacement of the Tautomeric Equilibrium of the Promutagen N6-Methoxyadenosine by Complementary Base Pairing. Biochemistry 23, 2906-13 (1984)
  2. R. Stolarski, B. Kierdaszuk, C-E Hagberg, D. Shugar, Mechanism of Hydroxylamine Mutagenesis: Tautomeric Shifts and Proton Exchange between the Promutagen N6-Methoxyadenosine and Cytidine. Biochemistry 26, 4332-4337 (1987)

Zagadnienia, które mogą pojawić się podczas kolokwium wstępnego:

  1. Na czym polega komplementarność zasad kwasów nukleinowych?
  2. Dlaczego komplementarne są A-U (A-T) i G-C, ale nie są komplementarne A-G, A-C i G-U(G-T)
  3. Jak powstają kompleksy zasad kwasów nukleinowych? Jaki jest rozkład przestrzenny zasad w kompleksach?
  4. Na czy polega równowaga tautomeryczna w przypadku zasad kwasów nukleinowych?
  5. Narysuj jedną z zasad kwasów nukleinowych i omów jej formy tautomeryczne? Która z tych form jest formą naturalną?
  6. Omów znane Ci oddziaływanie międzycząsteczkowe występujące w kompleksach zasad kwasów nukleinowych. Jakie atomy i ładunki uczestniczą w tych oddziaływaniach? Jaką rolę odgrywa rozkład ładunku elektronowego?
  7. Wymień parametry widm NMR i zastanów się które z nich zależą od równowagi tautomerycznej. Jak można zidentyfikować strukturę form tautomerycznych w roztworze? Czy równowaga tautomeryczna zależy od rozpuszczalnika?
  8. Jakie parametry opisujące asocjacje można otrzymać za pomocą spektroskopii NMR

Materiały

Syntezy pochodnych 2’,3’,5’-tri-O-metylo N6-metoxyadenozyny (OMe6A) i 2’,3’,5’-tri-O-etylocytydyny (C) wykonano w Zakładzie Biofizyki. Metanol, deuterowany chloroform (C2HCl3) i tetrametylosilan (Me4Si) zakupiono w firmie Merck (Niemcy).

Pomiar widm

Pomiary widm 1H NMR zostały wykonane dla roztworu 25 ml metanolu w 1 ml deuterowanego chloroformu (C2HCl3) i następujących jego rozcieńczeń (6x, 20x, 40x 100x, 200x, 600x). Ponadto wykonano pomiary widm 1H NMR pochodnej 2’,3’,5’-tri-O-metylo N6-metoxyadenozyny (OMe6A) i 2’,3’,5’-tri-O-etylocytydyny (C) swobodnych i w mieszaninach ekwimolarnych (1:1) w tych samych stężeniach w zakresie 0.005 — 0.2 M. Wszystkie widma zmierzone zostały w 20 °C dla roztworów w bezwodnym, deuterowanym chloroformie (C2HCl3) względem wewnętrznego odniesienia Me4Si.

Wyznaczenie stałych autoasocjacji i heteroasocjacji

Stała autoasocjacji [math](K_a)\;[/math] dla reakcji X + X ⇔ XX jest zdefiniowana w następujący sposób:

[math]K_a = \frac{C_{XX}}{C_{X^2}}\;[/math],

gdzie [math]X = \text{C}[/math], amino-OMe6A lub imino-OMe6A.

Stała heteroasocjacji [math](K_a*)\;[/math] dla reakcji X + Y ⇔ XY jest zdefiniowana w następujący sposób

[math]K_a* = \frac{C_{X}}{C_XC_Y}\;[/math],

gdzie [math]XY =\;[/math] C:OMe6A, tj. amino-OMe6A:C lub imino-OMe6A:C.

Warto pokazać, że

[math]K_a = \frac{(\delta_m - \delta_X) (\delta_{XX} - \delta_X)}{(2Co_X(\delta_{XX} - \delta_m)^2) }\;[/math]

oraz

[math]K_a* = \frac{(\delta_m - \delta_X) (\delta_{XX} - \delta_X)}{(CoX(\delta_{XY} - \delta_m))}\;[/math],

gdzie [math]\delta_m\;[/math] jest wielkością obserwowanego (zmierzonego) przesunięcia chemicznego; [math]\delta_X,\ \delta_{XX}\ \text{i}\ \delta_{XY}\;[/math] są wartościami granicznymi przesunięć chemicznych wyznaczonych dla [math]X,\ XX\ \text{i}\ XY\;[/math]; [math]Co_X\;[/math] jest wartością całkowitego stężenia [math]X = \text{C}\;[/math], amino-OMe6A lub imino-OMe6A (dla prawidłowego wyniku stężenia tautomerów należy skorygować zgodnie z populacja form tautomerycznych); [math]C_X,\ C_{XX},\ C_{Y}\ \text{i}\ C_{XY}\;[/math] są wartościami stężenia [math]X,\ XX,\ Y\ \text{i}\ XY\;[/math].

Z powodu znikania sygnału 1H NMR grupy aminowej w C i grupy N6-H w formie amino-OMe6A w wyniku zjawiska wymiany protonów w temperaturach powyżej -30°C pomiary zostały wykonane w temperaturze -40°C.

Wyniki

  1. Wykonać rysunki zależności wartości przesunięć chemicznych odpowiednich atomów wodoru w amino-OMe6A, imino-OMe6A i C od stężenia form tautomerycznych OMe6A i C, swobodnych i w mieszaninach.
  2. Wyznaczyć stałe autoasocjacji amino-OMe6A, imino-OMe6A i C oraz heteroasocjacji OMe6A:C.
  3. Wykonać analizę selektywnej heteroasocjacji C z formami tautomerycznymi OMe6A.
  4. Określić pochodzenie poszczególnych sygnałów 1H NMR w widmach metanolu w chloroformie? Dlaczego niezależnie od stężenia, niektóre z tych sygnałów są otoczone dwoma słabymi pikami lub rozszczepione są na multiplety?
  5. Dlaczego sygnały multipletowe wraz ze zmniejszaniem się stężenia metanolu wyostrzają się?
  6. Porównać natężenia integralne pików i wyjaśnić o czym one świadczą?
  7. Wykonać tabelkę i wykres zależności wartości przesunięcia chemicznego wodoru grupy OH w metanolu od jego stężenia. Zinterpretować tę zależność.