Pracownia Podstaw Biofizyki/PPB8

Spektroskopia ¹H NMR — asocjacja między zasadą modyfikowaną a zasadami potencjalnie komplementarnymi na przykładzie N⁶-metoksyadeniny

Wariant 1: wyznaczenie selektywnej asocjacji i stałej asocjacji dla kompleksu z cytydyną

dr hab. Borys Kierdaszuk

Wstęp

Molekularną podstawą specyficzności między zasadami kwasów nukleinowych jest precyzyjny system cyklicznych wiązań wodorowych tworzonych miedzy zasadami purynowymi i pirymidynowymi. Wiązania te są specyficzne, ponieważ adenina tworzy pary komplementarne tylko z uracylem (tyminą) a guanina tylko z cytozyną i obrazują komplementarność znalezioną przez Watsona i Cricka w strukturze DNA. W oryginalnej pracy z 1953 roku autorzy postulowali, że każda para A=T i G=C połączona jest dwoma wiązaniami wodorowymi, tymczasem trzy lata później Pauling i Corey wykazali obecność trzech wiązań wodorowych miedzy G i C.

Komplementarność miedzy zasadami kwasów nukleinowych może być zakłócona przez modyfikacje chemiczne zasad, które są wywołane przez środowiskowe mutageny chemiczne pochodzące z zanieczyszczeń. Przykładem takiej modyfikacji jest N⁶-metoxyadenozyna (OMe⁶A, Schemat Figure 1), produkt reakcji (transaminacji) adenozyny (A) z mutagenem chemicznym metoxyaminą (NH₂OCH₃). OMe⁶A jest promutagenem w różnych układach prokariotycznych i eukariotycznych, np. w drożdżach, Escherichia coli, Neurospora crassa oraz fibroblastach chomika. Promutagenne własności tego analogu są także potwierdzone in vitro poprzez jego dualną funkcjonalność w układach polimeraz RNA i DNA, gdzie OMe⁶A zachowuje jak A lub G. Dualne własności funkcjonalne OMe⁶A w tworzeniu par komplementarnych z niemodyfikowanymi zasadami kwasów nukleinowych odzwierciedlone są w jej równowadze tautomerycznej amino — imino (Schemat Figure 1), gdzie grupa N⁶-OCH₃ znajduje się w konformacji syn względem azotu N(1) pierścienia puryny. Równowaga tautomeryczna silnie zależy od środowiska (rozpuszczalnika) i zmienia się od ~90% zawartości formy aminowej w czterochlorku węgla do ~90% formy iminowej w środowisku wodnym. Ma ona kluczowe znaczenie dla tworzenia błędnej pary (ang. miss-pairing) z potencjalnie komplementarną C oraz molekularnego mechanizmu powstawania mutacji punktowych typu tranzycji A → G wywołanej obecnością OMe⁶A w mutagenezie środowiskowej indukowanej metoxyaminą.

Równowaga tautomeryczna amino-imino oraz rotameryczna syn-anti grupy egzocyklicznej N⁶-OMe względem N(1) pierścienia purynowego. Z powodu przeszkody sterycznej między O₆CH₃ i N(7) pierścienia purynowego, rotamer anti jest mniej prawdopodobny.

Pierwszy wariant ćwiczenia dotyczy wyznaczenia selektywnej asocjacji i stałych autoasocjacji amino-OMe⁶A, imino-OMe⁶A i C oraz heteroasocjacji OMe⁶A:C za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego jądra ¹H (ang. ¹H Nuclear Magnetic Resonace, ¹H NMR). Spektroskopia ¹H NMR bardzo dobrze nadaje się do zbadania równowagi tautomerycznej amino-iminowej oraz asocjacji z udziałem wiązań wodorowych, ponieważ w każdym z tych zjawisk atom wodoru ¹H znajduje się w zmiennym otoczeniu chemicznym wpływającym na własności sygnału rezonansowego. Równowaga tautomeryczna jest odzwierciedlona w formie dwóch zestawów sygnałów ¹H NMR o stałej proporcji między integralnymi natężeniami względnymi odpowiadającej populacji poszczególnych tautomerów (Rysunek Figure 2). Natomiast tworzeniu wiązań wodorowych z udziałem grup =N(1)-H lub =N⁶-H w tautomerach odpowiednio imino- OMe⁶A lub amino-OMe⁶A oraz grypy aminowej -NH₂ w C powinno towarzyszyć przesuniecie sygnału rezonansowego ¹H NMR.

Typowe widmo ¹H NMR pochodnej OMe⁶A in C₂HCl₃ zawierające dwa zestawy sygnałów pochodzących od form tautomerycznych amino i imino. Numery odpowiadają różnym jądrom atomów wodoru w cząsteczce. Wyższy sygnał w każdej parze odpowiada formie amino a niższy formie imino. Przesunięcia chemiczne są wyznaczone względem (Me)₄Si.

Wymagania dotyczące kolokwium wstępnego

1. Warunkiem przystąpienia do części eksperymentalnej ćwiczenia jest zaliczenie kolokwium wstępnego. Wybór sposobu przeprowadzenia kolokwium wstępnego tj. forma pisemna czy ustna, pytania otwarte czy zamknięte — należy do prowadzącego ćwiczenie.
2. Materiał z zakresu spektroskopii NMR obowiązujący w czasie kolokwium wstępnego i wykonywania ćwiczenia, przedstawiony został podczas wykładów „Spektroskopia molekularna” i „Fizyka atomów, cząsteczek i makrocząsteczek biologicznych”, a pewne jego rozszerzenie bądź ilustracja konkretnych zagadnień szczegółowych zawarta jest w dołączonych do opisu publikacjach (patrz poniżej). Chętnym pragnącym poszerzyć wiedzę nt. zastosowania spektroskopii NMR polecamy następującą pozycję literaturową: W. Zieliński i A. Rajca „Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych”(praca zbiorowa).

Publikacje dotycząca ćwiczenia:

1. R. Stolarski, B. Kierdaszuk, C-E Hagberg, D. Shugar, Hydroxylamine and Methoxyamine Mutagenesis: Displacement of the Tautomeric Equilibrium of the Promutagen N⁶-Methoxyadenosine by Complementary Base Pairing. Biochemistry 23, 2906-13 (1984)
2. R. Stolarski, B. Kierdaszuk, C-E Hagberg, D. Shugar, Mechanism of Hydroxylamine Mutagenesis: Tautomeric Shifts and Proton Exchange between the Promutagen N⁶-Methoxyadenosine and Cytidine. Biochemistry 26, 4332-4337 (1987)

Zagadnienia, które mogą pojawić się podczas kolokwium wstępnego:

1. Na czym polega komplementarność zasad kwasów nukleinowych?
2. Dlaczego komplementarne są A-U (A-T) i G-C, ale nie są komplementarne A-G, A-C i G-U(G-T)
3. Jak powstają kompleksy zasad kwasów nukleinowych? Jaki jest rozkład przestrzenny zasad w kompleksach?
4. Na czy polega równowaga tautomeryczna w przypadku zasad kwasów nukleinowych?
5. Narysuj jedną z zasad kwasów nukleinowych i omów jej formy tautomeryczne? Która z tych form jest formą naturalną?
6. Omów znane Ci oddziaływanie międzycząsteczkowe występujące w kompleksach zasad kwasów nukleinowych. Jakie atomy i ładunki uczestniczą w tych oddziaływaniach? Jaką rolę odgrywa rozkład ładunku elektronowego?
7. Wymień parametry widm NMR i zastanów się które z nich zależą od równowagi tautomerycznej. Jak można zidentyfikować strukturę form tautomerycznych w roztworze? Czy równowaga tautomeryczna zależy od rozpuszczalnika?
8. Jakie parametry opisujące asocjacje można otrzymać za pomocą spektroskopii NMR

Materiały

Syntezy pochodnych 2’,3’,5’-tri-O-metylo N⁶-metoxyadenozyny (OMe⁶A) i 2’,3’,5’-tri-O-etylocytydyny (C) wykonano w Zakładzie Biofizyki. Metanol, deuterowany chloroform (C₂HCl₃) i tetrametylosilan (Me₄Si) zakupiono w firmie Merck (Niemcy).

Pomiar widm

Pomiary widm ¹H NMR zostały wykonane dla roztworu 25 ml metanolu w 1 ml deuterowanego chloroformu (C₂HCl₃) i następujących jego rozcieńczeń (6x, 20x, 40x 100x, 200x, 600x). Ponadto wykonano pomiary widm ¹H NMR pochodnej 2’,3’,5’-tri-O-metylo N⁶-metoxyadenozyny (OMe⁶A) i 2’,3’,5’-tri-O-etylocytydyny (C) swobodnych i w mieszaninach ekwimolarnych (1:1) w tych samych stężeniach w zakresie 0.005 — 0.2 M. Wszystkie widma zmierzone zostały w 20 °C dla roztworów w bezwodnym, deuterowanym chloroformie (C₂HCl₃) względem wewnętrznego odniesienia Me₄Si.

Wyznaczenie stałych autoasocjacji i heteroasocjacji

Stała autoasocjacji [math](K_a)\;[/math] dla reakcji X + X ⇔ XX jest zdefiniowana w następujący sposób:

[math]K_a = \frac{C_{XX}}{C_{X^2}}\;[/math],

gdzie [math]X = \text{C}[/math], amino-OMe⁶A lub imino-OMe⁶A.

Stała heteroasocjacji [math](K_a*)\;[/math] dla reakcji X + Y ⇔ XY jest zdefiniowana w następujący sposób

[math]K_a* = \frac{C_{X}}{C_XC_Y}\;[/math],

gdzie [math]XY =\;[/math] C:OMe⁶A, tj. amino-OMe⁶A:C lub imino-OMe⁶A:C.

Warto pokazać, że

[math]K_a = \frac{(\delta_m - \delta_X) (\delta_{XX} - \delta_X)}{(2Co_X(\delta_{XX} - \delta_m)^2) }\;[/math]

oraz

[math]K_a* = \frac{(\delta_m - \delta_X) (\delta_{XX} - \delta_X)}{(CoX(\delta_{XY} - \delta_m))}\;[/math],

gdzie [math]\delta_m\;[/math] jest wielkością obserwowanego (zmierzonego) przesunięcia chemicznego; [math]\delta_X,\ \delta_{XX}\ \text{i}\ \delta_{XY}\;[/math] są wartościami granicznymi przesunięć chemicznych wyznaczonych dla [math]X,\ XX\ \text{i}\ XY\;[/math]; [math]Co_X\;[/math] jest wartością całkowitego stężenia [math]X = \text{C}\;[/math], amino-OMe⁶A lub imino-OMe⁶A (dla prawidłowego wyniku stężenia tautomerów należy skorygować zgodnie z populacja form tautomerycznych); [math]C_X,\ C_{XX},\ C_{Y}\ \text{i}\ C_{XY}\;[/math] są wartościami stężenia [math]X,\ XX,\ Y\ \text{i}\ XY\;[/math].

Z powodu znikania sygnału ¹H NMR grupy aminowej w C i grupy N⁶-H w formie amino-OMe⁶A w wyniku zjawiska wymiany protonów w temperaturach powyżej -30°C pomiary zostały wykonane w temperaturze -40°C.

Wyniki

1. Wykonać rysunki zależności wartości przesunięć chemicznych odpowiednich atomów wodoru w amino-OMe⁶A, imino-OMe⁶A i C od stężenia form tautomerycznych OMe⁶A i C, swobodnych i w mieszaninach.
2. Wyznaczyć stałe autoasocjacji amino-OMe⁶A, imino-OMe⁶A i C oraz heteroasocjacji OMe⁶A:C.
3. Wykonać analizę selektywnej heteroasocjacji C z formami tautomerycznymi OMe⁶A.
4. Określić pochodzenie poszczególnych sygnałów ¹H NMR w widmach metanolu w chloroformie? Dlaczego niezależnie od stężenia, niektóre z tych sygnałów są otoczone dwoma słabymi pikami lub rozszczepione są na multiplety?
5. Dlaczego sygnały multipletowe wraz ze zmniejszaniem się stężenia metanolu wyostrzają się?
6. Porównać natężenia integralne pików i wyjaśnić o czym one świadczą?
7. Wykonać tabelkę i wykres zależności wartości przesunięcia chemicznego wodoru grupy OH w metanolu od jego stężenia. Zinterpretować tę zależność.